神経活動に伴う神経形態変化を可視化する分子プローブの開発

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新生シナプスを可視化するための分子プローブとして、(1)樹状突起の活性化部位にmRNAが輸送される最初期遺伝子Arc mRNAの3'非翻訳領域(UTR)を利用した分子プロープの作製、及び(2)樹状突起に輸送される新規のUTRをスクリーニングするベクターの開発を目指し、以下の成果を得た。1.Arc cDNAのクローニング〜樹状突起輸送配列の同定Arc mRNAの樹状突起輸送を単一神経細胞レベルで確認し、この輸送に必要なシグナルが、Arc mRNA内の約500塩基の配列中に存在する事を明らかにした(Kobayashi et al.,2003;論文投稿準備中)。既知の樹状突起輸送シグナルとの1次配列や2次構造の比較から、この領域に新規の輸送シグナルが存在する事が期待される。現在、この配列の輸送先を、蛍光蛋白質EGFPを用いて可視化するためのプラスミドベクターを作成中である(下記参照)。又、これと平行して、抗Arc抗体を用いた免疾染色により,Arc蛋白質がシナプス形成時にシナプスに集積する事を明らかにし、組み換えArcを弾制発現させた実験から、Arc蛋白質がスパインの運動性を増強する事を見いだした(Kobayashi et al.,2002)。2.mRNA樹状突起輸送及び局所翻訳を可視化するベクターの開発蛍光レポーターEGFPを用いて、細胞体と樹状突起での翻訳産物を区別するために、細胞体で翻訳されたものが核に移行するように核移行シグナル(NLS)を持たせ、樹状突起で翻訳されたものはシナプス近傍に留まるようにアンカーリングモチーフ(PDZ binding motif)を持たせたレポータープラスミドを作製した。現在、テストUTRとして、樹状突起輸送活性を持つMAP2またはArc mRNAの樹状突起輸送シグナルを挿入し、その有効性の検証を行っている。