高効率切断活性または新規な基質特異性をもつ人工リボザイムの合成と応用に関する研究

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本研究は、固定化RNAとPCR(polymerase chain reaction)法を用いた新規に考案した手法によって、現在まで知られていない高効率切断活性を持つRNA酵素や、全く新しい基質特異性を持つRNA酵素を、一部分が任意の配列を持つ人工的に合成したRNAプールの中から選択増幅し、それらの構造を詳細に解析することで、RNA酵素の活性と構造との相関関係を明かにすることを目的としている。平成4年度では、まず固定化RNAを作成し、任意な配列をもつRNAプールから切断活性を持つRNA酵素を選択増幅する最適な反応条件を確立した。次に、第一段階として、ヘアピン型RNA酵素を出発材料に用い、ヘアピン型RNA酵素による切断箇所に近い内部ループ領域4塩基を任意な配列として持つ変異RNAプール(4^4=256種類のRNAからなるプール)から、固定化RNAを用いて選択増幅実験を実際に行った。2回の選択増幅反応を行ったところ、野性型のRNA酵素と同程度の切断活性を持つRNAプールが得られた。そのRNAプールから任意に選んだ24個のクローンによる切断活性を調べたところ、全てのクローンが切断活性を示し、今回開発した固定化RNAを用いた選択的増幅反応法が極めて有効であることが解った。更に得られたクローンの塩基配列を決定した結果、ヘアピン型RNA酵素においては切断箇所に近い内部ループ領域4塩基中の真中の2塩基GAが切断活性に必須であることが判明した。現在、更に別の箇所の内部ループ領域に変異を導入したプールを作成して解析中である。