分裂酵母を用いたRev蛋白及びRev蛋白結合因子の解析

Rev 蛋白を分裂酵母内で発現させ、RRE 配列を持つレポーター遺伝子から転写されたmRNAの核外輸送に与える影響を解析するため、分裂酵母においてRev蛋白を発現させるプラスミド及びレポーター遺伝子を構築した。レポーター遺伝子pDBal-lacZ2-RREは、スプライシングされなくて前駆体mRNAのまま該外輸送されるとlacZの読み枠と一致する(スプライシングされると読み枠がずれてlacZが発現しない)mRNAを産生する様に設計されている。まず、Rev蛋白を分裂酵母内で発現させ、Rev蛋白の細胞内における局在を調べたところ、分裂酵母内で発現されたRev蛋白は、動物細胞の場合と同様に、核内へと移行した。興味深いことに、共焦点レーザー顕微鏡にて、さらに核内での分布を調べたところ、Rev蛋白は酵母核の核小体側の核膜付近に、多量に局在していることが明らかとなった。この結果は、Rev蛋白と相互作用する因子が、酵母に於いては、核小体側の核膜付近に存在している可能性を示唆する。また、RRE配列を持たないレポーター遺伝子とRev蛋白発現プラスミドを同時に分裂酵母に導入し、Rev蛋白を発現させたときのX-galプレート上でのコロニー発色を解析したが、RRE配列を持たない前駆体mRNAは、Rev蛋白による核外輸送の促進を受けないことが判明した。今後、Rev発現プラスミドとpDBa1-1acZ1-RREレポータープラスミド(成熟mRNAが核外輸送されると発色する)を導入した野生型の分裂酵母を、突然変異誘発剤で処理し、RRE配列を持つにも関わらず、レポーター遺伝子からのmRNAがほとんどスプライシングされて、成熟mRNAとして細胞質へと輸送される変異株を、LacZによる発色の程度を指標としてスクリーニングし、Rev蛋白と相互作用する可能性のある因子を同定する予定である。

Rev 蛋白を分裂酵母内で発現させ、RRE 配列を持つレポーター遺伝子から転写されたmRNAの核外輸送に与える影響を解析するため、分裂酵母においてRev蛋白を発現させるプラスミド及びレポーター遺伝子を構築した。レポーター遺伝子pDBal-lacZ2-RREは、スプライシングされなくて前駆体mRNAのまま該外輸送されるとlacZの読み枠と一致する(スプライシングされると読み枠がずれてlacZが発現しない)mRNAを産生する様に設計されている。まず、Rev蛋白を分裂酵母内で発現させ、Rev蛋白の細胞内における局在を調べたところ、分裂酵母内で発現されたRev蛋白は、動物細胞の場合と同様に、核内へと移行した。興味深いことに、共焦点レーザー顕微鏡にて、さらに核内での分布を調べたところ、Rev蛋白は酵母核の核小体側の核膜付近に、多量に局在していることが明らかとなった。この結果は、Rev蛋白と相互作用する因子が、酵母に於いては、核小体側の核膜付近に存在している可能性を示唆する。また、RRE配列を持たないレポーター遺伝子とRev蛋白発現プラスミドを同時に分裂酵母に導入し、Rev蛋白を発現させたときのX-galプレート上でのコロニー発色を解析したが、RRE配列を持たない前駆体mRNAは、Rev蛋白による核外輸送の促進を受けないことが判明した。今後、Rev発現プラスミドとpDBa1-1acZ1-RREレポータープラスミド(成熟mRNAが核外輸送されると発色する)を導入した野生型の分裂酵母を、突然変異誘発剤で処理し、RRE配列を持つにも関わらず、レポーター遺伝子からのmRNAがほとんどスプライシングされて、成熟mRNAとして細胞質へと輸送される変異株を、LacZによる発色の程度を指標としてスクリーニングし、Rev蛋白と相互作用する可能性のある因子を同定する予定である。