固定化RNA選択法を用いたRNA酵素機能構造の解析

RNA酵素(リボザイム)とは、その活性に蛋白質性因子の関与を必要とせず、RNA単独で、RNA鎖切断等の蛋白質酵素様の触媒活性を示すRNA分子の総称である。本研究は、我々の開発した固定化RNA選択法を用いて、全く任意の配列を持つRNA集団から、切断活性を持つRNA酵素のみを分離し、それらの構造を解析することにより、RNA酵素の構造と触媒活性との相関関係を解明することを目的としたものである。我々は、ミニハンマーヘッド型RNA酵素を母体とし、保存配列が含まれるステムII領域の14塩基全てを、任意な配列にしたRNA集団(つまり基質と水素結合を形成する領域以外は、全て任意な配列を持つ4^<14>=2.7X10^8種類からなるRNAの集団)より、基質RNAに対する切断活性を持つRNA分子を、固定化RNA選択法を利用して分離する事を行った。7回の固定化RNAによる選択、及びPCRによる増幅サイクルを繰り返したところ、選択されてきたRNA集団に基質RNAを切断する活性が検出された。そこで、そのRNA集団から、RT-PCRによって個々のRNAのcDNAを作製し、そのうちの40クローンについて構造を解析した。その結果、基質RNAに対して切断活性を示すクローンは、1塩基のみ異なる3種類の塩基配列を持つことが明らかになった。これらの3種類のRNA酵素は、全て典型的なハンマーヘッド型リボザイムの保存配列と同一の配列を含んでいた。また、全く独立に、再度固定化RNAによる選択を繰り返したが、切断活性を持つRNA酵素としては、1回目の選択実験と同一の配列を持つクローンのみが得られた。これらの結果は、用いた基質RNAに対して、切断活性を示すRNA酵素の触媒部位には、典型的なハンマーヘッド型リボザイムの保存配列が必須であり、その他の構造をもつRNA酵素は存在しない可能性を示唆している。

RNA酵素(リボザイム)とは、その活性に蛋白質性因子の関与を必要とせず、RNA単独で、RNA鎖切断等の蛋白質酵素様の触媒活性を示すRNA分子の総称である。本研究は、我々の開発した固定化RNA選択法を用いて、全く任意の配列を持つRNA集団から、切断活性を持つRNA酵素のみを分離し、それらの構造を解析することにより、RNA酵素の構造と触媒活性との相関関係を解明することを目的としたものである。我々は、ミニハンマーヘッド型RNA酵素を母体とし、保存配列が含まれるステムII領域の14塩基全てを、任意な配列にしたRNA集団(つまり基質と水素結合を形成する領域以外は、全て任意な配列を持つ4^<14>=2.7X10^8種類からなるRNAの集団)より、基質RNAに対する切断活性を持つRNA分子を、固定化RNA選択法を利用して分離する事を行った。7回の固定化RNAによる選択、及びPCRによる増幅サイクルを繰り返したところ、選択されてきたRNA集団に基質RNAを切断する活性が検出された。そこで、そのRNA集団から、RT-PCRによって個々のRNAのcDNAを作製し、そのうちの40クローンについて構造を解析した。その結果、基質RNAに対して切断活性を示すクローンは、1塩基のみ異なる3種類の塩基配列を持つことが明らかになった。これらの3種類のRNA酵素は、全て典型的なハンマーヘッド型リボザイムの保存配列と同一の配列を含んでいた。また、全く独立に、再度固定化RNAによる選択を繰り返したが、切断活性を持つRNA酵素としては、1回目の選択実験と同一の配列を持つクローンのみが得られた。これらの結果は、用いた基質RNAに対して、切断活性を示すRNA酵素の触媒部位には、典型的なハンマーヘッド型リボザイムの保存配列が必須であり、その他の構造をもつRNA酵素は存在しない可能性を示唆している。