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カエル水晶体のρ-クリスタリンのクローニングと人工変異の導入-グルコース還元酵素活性の放棄と復元-

青蛙晶状体ρ-晶状体蛋白的克隆和人工突变的引入-葡萄糖还原酶活性的放弃和恢复-

基本信息

批准号：
05807161
负责人：
藤井豊
金额：
$ 1.09万
依托单位：
福井医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ρ-クリスタリン(RHO)のクローニングと蛋白質の発現系を確立し、発現RHO蛋白質の蛋白質化学的及び酵素化学的性質の解析を目標とし、当該年度においてその目的は予定どおり達成された。1.RHOのクローニングの完了:カエル水晶体より常法によりmRNAよりcDNAを調製し、1-1.5KbpのcDNA画分をλzapベクターを用いてcDNAライブラリーとした。2つのプライマー(GAGAGATCTCTGAGGGATGTTGGA及びATGGGGAAGGTGCTACTCATGACT)を合成しPCRにて675bpのプローブを調製してからcDNAライブラリーより全長をコードするcDNAをスクリーニングした。陽性のクローンを単離しサブクローニングの後、開始コドンATGから975bpの翻訳領域を含む全長1203bpの塩基配列を決定した。2.大腸菌からのRHO蛋白質の発現系の確立:pUC18のβ-galactosidaseの開始コドンATGにRHOの翻訳領域を連結した発現ベクターを調製し、大腸菌HB101を形質転換してRHOのN末端アミノ酸Thrより始まる完全な蛋白質の発現に成功した。3.発現RHOの酵素活性の欠落の確認:大腸菌HB101より発現したRHOのN末端アミノ酸はフリーで存在しているのでカエル水晶体RHOのII型(RHO-II)に相当することが判明した。発現RHOの精製は水晶体RHOと基本的に同じであり、Red-Sepharose,Sephadex G-100並びにDEAE-Toyopear,hydroxyappatide,Octyl Sepharoseクロマトにより電気泳動上単一に精製した。この発現RHOの酵素活性は水晶体RHOと同様検出できなかった。よってRHOはもともと酵素活性が欠落しているアルド・ケト還元酵素型蛋白質であると確認した。現在プロスタグランジンF合成酵素とのキメラを調製しその酵素学的な検討を行っています。

To establish the protein development system of rho-3 (RHO), to develop the protein chemistry and enzyme chemistry properties of RHO protein, and to achieve the objectives set for the year. 1. RHO cDNA sequence is complete: cDNA sequence is modulated by cDNA sequence, 1-1.5Kbp cDNA sequence is modulated by cDNA sequence. 2. PCR was synthesized by combining 675bp cDNA fragments (GAGAGATCTGAGGGATGTTGGA and ATGGGAAGGCTACTCATGACT) with full-length cDNA fragments. After the positive reaction, the ATG sequence was determined from 975bp to 1203bp. 2. Establishment of the protein production system for Escherichia coli RHO: pUC18 β-galactosidase initiation site ATG, RHO translation domain link, development site modulation, Escherichia coli HB101 qualitative transformation, RHO N-terminal amino acid Thr initiation, complete protein production success. 3. Confirmation of enzyme activity of RHO: Escherichia coli HB101 was detected and the N-terminal amino acid of RHO was detected. RHO was found to be a refined crystal. RHO was purified by the same method as RHO, Red-Sepharose,Sephadex G-100 and DEAE-Toyopear, Hydroxyapeptide,Octyl Sepharose. The enzyme activity of RHO is similar to that of crystal RHO. The enzyme activity of RHO was not detected. Now, we're going to do some research on enzyme synthesis and modulation.