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カエル水晶体のρ-クリスタリンのクローニングと人工変異の導入-グルコース還元酵素活性の放棄と復元-

青蛙晶状体ρ-晶状体蛋白的克隆和人工突变的引入-葡萄糖还原酶活性的放弃和恢复-

基本信息

批准号：
05807161
负责人：
藤井豊
金额：
$ 1.09万
依托单位：
福井医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ρ-クリスタリン(RHO)のクローニングと蛋白質の発現系を確立し、発現RHO蛋白質の蛋白質化学的及び酵素化学的性質の解析を目標とし、当該年度においてその目的は予定どおり達成された。1.RHOのクローニングの完了:カエル水晶体より常法によりmRNAよりcDNAを調製し、1-1.5KbpのcDNA画分をλzapベクターを用いてcDNAライブラリーとした。2つのプライマー(GAGAGATCTCTGAGGGATGTTGGA及びATGGGGAAGGTGCTACTCATGACT)を合成しPCRにて675bpのプローブを調製してからcDNAライブラリーより全長をコードするcDNAをスクリーニングした。陽性のクローンを単離しサブクローニングの後、開始コドンATGから975bpの翻訳領域を含む全長1203bpの塩基配列を決定した。2.大腸菌からのRHO蛋白質の発現系の確立:pUC18のβ-galactosidaseの開始コドンATGにRHOの翻訳領域を連結した発現ベクターを調製し、大腸菌HB101を形質転換してRHOのN末端アミノ酸Thrより始まる完全な蛋白質の発現に成功した。3.発現RHOの酵素活性の欠落の確認:大腸菌HB101より発現したRHOのN末端アミノ酸はフリーで存在しているのでカエル水晶体RHOのII型(RHO-II)に相当することが判明した。発現RHOの精製は水晶体RHOと基本的に同じであり、Red-Sepharose,Sephadex G-100並びにDEAE-Toyopear,hydroxyappatide,Octyl Sepharoseクロマトにより電気泳動上単一に精製した。この発現RHOの酵素活性は水晶体RHOと同様検出できなかった。よってRHOはもともと酵素活性が欠落しているアルド・ケト還元酵素型蛋白質であると確認した。現在プロスタグランジンF合成酵素とのキメラを調製しその酵素学的な検討を行っています。

ρ-クリスタリン(RHO) no protein Analysis of the chemical properties of enzymes and enzymes is a target, and the target for the year is determined to be achieved. 1.RHO's のクローニングのfinished: カエル Crystal よりregular method によりmRNA よりcDNA を Modulation し, 1-1.5Kbp のcDNA draw points をλzap ベクターを use いてcDNAライブラリーとした. 2つのプライマー(GAGAGATCTCTGAGGGATGTTGGA and びATGGGGAAGGTGCTACTCATGACT)をSynthetic PCR 675bp のプローブをmodulation してからcDNAライブラリーよりFull length をコードするcDNAをスクリーニングした. After positive のクローンを単しサブクローニングの, start コドンATGからThe 975bp translation field contains the full-length 1203bp base sequence. 2. Establishment of the current lineage of Escherichia coli's RHO protein: pUC18's β-galactosidase's start and ATG's RHO translation domain The result is that the coliform HB101 morphogen is modified and the N-terminal acid of Escherichia coli HB101 is modified. 3. Confirmation of lack of enzyme activity of RHO: coliform HB101 N-terminal amino acid of RHO The existence of the フリーでしているのでカエルcrystal RHOのII type (RHO-II) is quite clear. RHO's refined crystal RHO's basic RHO, Red-Sepharose, Sephadex G-100 and DEAE-Toyopear, hydroxyappatide, Octyl Sepharose クロマトにより electrophoresis on single に refined した. The enzyme activity of RHO is the same as the enzyme activity of crystal RHO.よってRHOはもともとEnzyme activity is low, しているアルド・ケトreducing enzyme type protein, であるとconfirmation. Now the プロスタグランジンF synthetic enzyme とのキメラを modulated しそのzyme science's な検を行っています.