高温性バチルスのウレアーゼの成熟活性化機構の遺伝生化学的研究

嗜热芽孢杆菌脲酶成熟和激活机制的遗传学和生化研究

• 批准号: 06660092
• 负责人: 日高 真誠
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06660092/
• 关键词: ウレアーゼ; アクセサリー遺伝子; アポ蛋白質; ニッケル; 蛋白質複合体

高温性バチルス属TB-90のウレアーゼ遺伝子クラスターに存在する6個のアクセサリー遺伝子(ureE,ureF,ureG,ureD,ureH,ureI)の機能の解析を目指した。1.アクセサリー遺伝子産物に対する抗体の作製各アクセサリー遺伝子産物を大腸菌マルトース結合蛋白質との融合蛋白質として精製し、これを用いて抗体を作製した。ただし、UreHとUreIの融合蛋白質の生産量は微量であったため、抗体作製には至らなかった。2.アクセサリー遺伝子産物の大腸菌菌体内での発現量と分布TB-90株ウレアーゼ遺伝子クラスターを大腸菌に導入し、その菌体破砕液に対する上記抗体を用いた解析を行い、アクセサリー遺伝子産物を同定した。UreGとUreEはSDS-PAGEでもバンドが確認できるほど大量に産生されており、可溶性蛋白質であった。一方、UreDは抗体でのみ検出できる程度の産生量しかなく、可溶性蛋白質であるものの一部ウレアーゼ蛋白質と共に不溶性画分に分布することが示された。さらに、UreFは抗体を用いても検出できず、非常に産生量の少ないあるいは分解の速い蛋白質であると考えられる。なお、UreEは可溶性蛋白質として大量に産生された後なんらかの修飾を受ける可能性が示唆された。3.UreDの機能TB-90株ウレアーゼ遺伝子クラスターを導入した大腸菌菌体抽出液にニッケル添加するとウレアーゼに構造変化が生じた。そこで、ウレアーゼ成熟活性中間体と考えられる蛋白質を解析したところ、ウレアーゼ蛋白質とUreDとの複合体があることが明らかとなった。従って、UreDはウレアーゼアポ蛋白質にニッケルイオンが組み込まれ活性型に成熟化する段階でアポ蛋白質の安定化に寄与していると考えられる。

The analysis of the functions of the six components (ureE,ureF,ureG,ureD,ureH,ureI) of TB-90, which is a high temperature resistant component, is presented. 1. Preparation of antibodies against recombinant protein products of Escherichia coli and fusion proteins of recombinant protein products of Escherichia coli The production of fusion protein is very small, and antibody production is very small. 2. Detection and distribution of E. coli DNA products TB-90 strain of E. coli DNA was introduced into E. coli, and the antibody against E. coli DNA was analyzed and identified. UreG and UreE were identified by SDS-PAGE, and soluble proteins were produced in large quantities. For example, UreD antibody production, soluble protein production and insoluble protein distribution are shown. UreF antibody is used to detect and detect the protein in a very small amount. UreE soluble protein is produced in large quantities, and the possibility of modification is indicated. 3. UreD's function TB-90 strain is introduced into Escherichia coli extract, and its structure is changed. Therefore, the analysis of the mature active intermediate and the Kaoerai protein, and the discovery of the complex of the Kaoerai protein and UreD are clear. In addition, UreD can also be used for protein stabilization.