L型ピルビン酸キナーゼ遺伝子のエンハンサーユニットに結合する転写因子の構造と機能

L型丙酮酸激酶基因增强子结合转录因子的结构和功能

基本信息

批准号：
06670140
负责人：
野口民夫
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06670140/
关键词：
L型ピルビン酸キナーゼ転写因子 NF1ファミリー HNF4

项目摘要

本研究はL型ピルビン酸キナーゼ(LPK)遺伝子の肝細胞特異的転写の制御機構や食餌性炭水化物による転写の制御機構を解明することを目的とし、エンハンサーユニットのLIIとLIIIに結合する転写因子の同定を行った。1、LII結合タンパク質は熱安定性の異なる少なくとも2種類のタンパク質が存在したので、熱に安定なタンパク質をラット肝の核抽出液から精製し、そのペプチド断片のアミノ酸配列を解析した。その結果、NF1ファミリーに属するハムスターのNF1/Res1と非常に高い相同性があることが判明した。NF1の抗体を用いてバンドシフト法で解析したところ、核抽出液中のLIIに結合する熱安定性のタンパク質はこの抗体と反応することが認められた。一方、熱に不安定なタンパク質は抗体を用いた実験からHNF4であることが証明された。HNF4は肝癌細胞で発現させた時、LII活性を著明に促進したが、NF1についてはNF1ファミリーに属するNF1Lを発現させたところ、約2倍の活性促進が認められた。2、LIIIに結合する核タンパク質は酵母を用いてクローニングを行った。すなわち、酵母の発現ベクターを用いてcDNAライブラリーを作成し、これをHIS遺伝子の上流にタンデムにLIIIを結合したレポーターをもつhis-の酵母にトランスフェクトし、his+の酵母を選択することにより行った。その結果、2個のクローンが得られた。これらの塩基配列を解析したところ、2個のクローンは同じ配列を有するがポリAの付加部位が異なることが判明した。オープンリーディングフレームから導きだしたアミノ酸配列はマウスのHEXと呼ばれるホメオドメインをもつタンパク質と97%の相同性を有していた。

这项研究旨在阐明L型丙酮酸激酶（LPK）基因的肝细胞特异性转录的机制以及膳食碳水化合物的转录机制，以及与增强子单位LII和LIII结合的转录机制。 1。由于LII结合蛋白至少存在至少两种具有不同热稳定性的蛋白质，因此从大鼠肝脏的核提取物中纯化了热稳定蛋白，并分析了肽片段的氨基酸序列。结果表明，属于NF1家族的仓鼠NF1/Res1具有很高的同源性。使用带有带移方法的NF1抗体进行分析表明，在核提取物中与LII结合的热稳定蛋白与该抗体反应。另一方面，使用抗体的实验证明了热法蛋白为HNF4。当在肝癌细胞中表达HNF4时，它显着促进了LII活性，但是当表达属于NF1家族的NF1L时，发现活动的促进了大约两倍。 2。使用酵母克隆与LIII结合的核蛋白。也就是说，使用酵母表达载体创建了一个cDNA库，然后将其转染到His-Yeast中，该酵母的记者在其基因上游的Liii绑定串联串联，然后选择了他的+酵母。结果是两个克隆。当分析这些核苷酸序列时，发现两个克隆具有相同的序列，但是Polya的添加位点不同。源自开放式阅读框的氨基酸序列具有97％的同源性，带有蛋白质，带有同源域称为小鼠六边形。