L型ピルビン酸キナーゼ遺伝子のエンハンサーユニットに結合する転写因子の構造と機能

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本研究はL型ピルビン酸キナーゼ(LPK)遺伝子の肝細胞特異的転写の制御機構や食餌性炭水化物による転写の制御機構を解明することを目的とし、エンハンサーユニットのLIIとLIIIに結合する転写因子の同定を行った。1、LII結合タンパク質は熱安定性の異なる少なくとも2種類のタンパク質が存在したので、熱に安定なタンパク質をラット肝の核抽出液から精製し、そのペプチド断片のアミノ酸配列を解析した。その結果、NF1ファミリーに属するハムスターのNF1/Res1と非常に高い相同性があることが判明した。NF1の抗体を用いてバンドシフト法で解析したところ、核抽出液中のLIIに結合する熱安定性のタンパク質はこの抗体と反応することが認められた。一方、熱に不安定なタンパク質は抗体を用いた実験からHNF4であることが証明された。HNF4は肝癌細胞で発現させた時、LII活性を著明に促進したが、NF1についてはNF1ファミリーに属するNF1Lを発現させたところ、約2倍の活性促進が認められた。2、LIIIに結合する核タンパク質は酵母を用いてクローニングを行った。すなわち、酵母の発現ベクターを用いてcDNAライブラリーを作成し、これをHIS遺伝子の上流にタンデムにLIIIを結合したレポーターをもつhis-の酵母にトランスフェクトし、his+の酵母を選択することにより行った。その結果、2個のクローンが得られた。これらの塩基配列を解析したところ、2個のクローンは同じ配列を有するがポリAの付加部位が異なることが判明した。オープンリーディングフレームから導きだしたアミノ酸配列はマウスのHEXと呼ばれるホメオドメインをもつタンパク質と97%の相同性を有していた。