Study of molecular mechanism of protein translocation through biochemical analysis of mutant secY in Escherichia coli

通过大肠杆菌突变体secY的生化分析研究蛋白质易位的分子机制

基本信息

  • 批准号:
    06680582
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.41万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
  • 财政年份:
    1994
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1994 至 1995
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

In the field of protein translocation analyzes in Escherichia coli, it is the most urgent theme to analyze a variety of sec mutants in vitro, especially, to compare their biochemical nature in a purified form. My aim in this project is purification of wild type and mutant SecY proteins both in a monomer and a complex with SecE and SecG.Using His_6-tagging method, I succeeded to purify wild type and 6 mutant forms of SecY including SecY39, a cs allele of secY,in SecYEG complexes and the wild type SecE monomer. The purified wild type SecYEG complex by this procedure retained protein translocation activity measured by reconstitution of SecYEG proteoliposome. Now I am trying, as the next step, to analyze and compare the purified complexes from the point of the following views ; 1) affinity to secretory precursors, 2) affinity to SecA ATPase, 3) effects on the membrane insertion and de-insertion of SecA,and 4) effects on an early stage of protein translocation through the analysis of Ni^<2+> inhibition of His_6-tagged pro-OmpA translocation.During the purification and protein translocation analysis of His_6-tagged pro-OmpA,a model protein of secretory precursor I used, I found that its translocation acquired Ni^<2+> sensitivity if a His_6 tag is inserted into the N-terminal region of the mature OmpA domain. The inhibitory effect by Ni^<2+> is neutralized by histidine and by using membrane vesicles prepared from prlA3, an allele of secY that is thought to broaden signal recognition specificity of translocase. Ni^<2+> is only effective in a post-targeting stage of the protein translocation, and also inhibited chemical cross-linking between pro-OmpA and SecY.These results demonstrated a possibility that Sec YEG complex directly recognizes secretory precursors in an early stage of the translocation.
在大肠杆菌蛋白质易位分析领域,对各种SEC突变体进行体外分析,尤其是对它们的生化性质进行纯化比较,是目前最迫切的课题。本课题的目的是从SecE和SecG的单体和复合体中分离纯化野生型和突变型SecY蛋白。利用His_6标记的方法,成功地从SecYEG复合体和野生型SecE单体中提纯了SecY的野生型和6种突变形式,其中包括SecY的cs等位基因SecY39。用此方法纯化的野生型SecYEG复合体通过重组SecYEG蛋白脂质体保持了蛋白转位活性。作为下一步,我试图从以下几个角度对纯化的复合体进行分析和比较:1)对分泌前体的亲和力,2)对SecA ATPase的亲和力,3)对SecA膜插入和去插入的影响,4)对蛋白质转位早期的影响,通过对Ni^&lt;2+&gt;抑制His_6标记的前OmpA转位的分析。如果将His_6标签插入到成熟OmpA结构域的N-末端区域,则具有敏感性。组氨酸和由Secy的等位基因prlA3制备的膜小泡可扩大转位酶的信号识别特异性,从而中和了Ni^&lt;2+&gt;的抑制作用。Ni^&lt;2+&gt;仅在蛋白质转位的后靶向阶段有效,并抑制原OmpA和SecY之间的化学交联。这些结果表明,SEC YEG复合体可能在转位的早期直接识别分泌前体。

项目成果

期刊论文数量(34)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Yoshinori Akiyama: "FcsH, a membrane-bound ATPase,forms a cpmplex in the cytoplasmil mombrane of Escherichia coli" J. Bid. Chem.270. 23485-23490 (1995)
Yoshinori Akiyama:“FcsH,一种膜结合的 ATP 酶,在大肠杆菌的细胞质膜中形成 cpmplex”J. Bid。
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    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Takashi Shimoike: "Product of a new gene, syd, functionally interactg with SecY when ourproduced in Esherichia coli" J. Bid. Chem.270. 5519-5526 (1995)
Takashi Shimoike:“当我们在大肠杆菌中生产时,新基因 syd 的产物在功能上与 SecY 相互作用”J. Bid。
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  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Yoshinori Akiyama et al.: "FtsH,a membrane-bound ATPase, forms a complex in the cytoplasmic membrane of Escherichia coli" J.Biol.Chem.270. 23485-23490 (1995)
Yoshinori Akiyama 等人:“FtsH,一种膜结合 ATP 酶,在大肠杆菌的细胞质膜中形成复合物”J.Biol.Chem.270。
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    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Tadashi Baba: "A cytoplasmic domain is important for the formation of a SecY-SecE translocator complex" Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.91. 4539-4543 (1994)
Tadashi Baba:“细胞质结构域对于 SecY-SecE 易位复合物的形成很重要”Proc。
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    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
Takashi Shimoike: "Product of a New Gene,Syd,Functionally Interacts with SecY when Overproduced in Eslenichia Coli." J.Biol. Chem.270. 5519-5526 (1995)
Takashi Shimoike:“新基因 Syd 的产物,当在大肠杆菌中过量产生时,会与 SecY 发生功能性相互作用。”
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    $ 1.41万
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  • 批准号:
    05858081
  • 财政年份:
    1993
  • 资助金额:
    $ 1.41万
  • 项目类别:
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