造血系転写因子RUNX1のユビキチン化修飾および分解制御機構の解明

造血转录因子RUNX1泛素化修饰及降解控制机制的阐明

• 批准号: 15H06162
• 负责人: 合山 進
• 金额: $ 1万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-08-28 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H06162/
• 关键词: RUNX1; ユビキチン化修飾; 造血器腫瘍

造血系転写因子RUNX1の発現、活性は精緻に制御されており、その破綻は造血器腫瘍発症の原因となる。RUNX1の機能はユビキチン-プロテアソーム系を介した調節を受けることが知られているが、その詳細なメカニズムはほとんどわかっていない。今回我々は、高感度かつハイスループットにユビキチン化を検出可能なユビキチン化アッセイ法を用いて 約300種類のユビキチン化酵素プロテインアレイとRUNX1を対象にスクリーニングを行い、 RUNX1のユビキチン化修飾を誘導する候補分子を同定した。この中には、STUB1など既知のRUNX1ユビキチン化誘導酵素が含まれており、スクリーニングは正しく働いていると考えられた。さらに我々は、個々の候補ユビキチン化酵素とRUNX1の関係を詳細に検討し、RUNX1ユビキチン化を誘導する分子を複数同定した。また、RUNX1タンパクの安定性をGFPとmCherryの蛍光強度の比で評価することのできるレポーター細胞を用いて、個々のユビキチン化酵素をノックダウンした時のGFP/mCherry蛍光強度の変化を検証した。この実験では、意外にも個々のユビキチン化酵素ノックダウンによるRUNX1タンパクの大幅な発現増加は認めなかった。この結果は、RUNX1のユビキチン化修飾及び安定性は複数の酵素により複合的に制御されており単一分子のノックダウンでは大きく変化しないことを示唆している。もしくは、我々が同定したRUNX1ユビキチン化誘導分子の中に、RUNX1の分解を促進するのではなく機能調節を行うものが含まれている可能性もある。今後は、個々の分子により誘導されるRUNX1ユビキチン化修飾の役割を明らかにするとともに、ゲノム編集技術を用いてRUNX1ユビキチン化酵素の欠失を誘導し、その生理的意義を解明する。

造血转录因子Runx1的表达和活性得到了精确控制，其失败会导致造血肿瘤的发展。尽管已知Runx1的功能是通过泛素 - 蛋白酶体系统调节的，但其详细机制在很大程度上是未知的。在本文中，我们使用泛素化测定法筛选了大约300个泛素化酶蛋白阵列和Runx1，该测定法可以检测高灵敏度和高吞吐量中的泛素化，并鉴定出诱导Runx1的泛素化修饰的候选分子。这包括已知的Runx1泛素化诱导酶，例如Stub1，并且筛选被认为正常工作。此外，我们已经详细研究了个体候选泛素酶和runx1之间的关系，并确定了诱导Runx1泛素化的几个分子。此外，使用GFP和MCHERRY的荧光强度之比来评估RUNX1蛋白稳定性的报告细胞用于验证单个泛素酶敲低时GFP/MCHERRY荧光强度的变化。令人惊讶的是，由于单个泛素酶敲低，该实验并未显示出Runx1蛋白表达的显着增加。结果表明，Runx1的泛素化修饰和稳定性由多种酶复杂控制，并且随着单分子敲低的影响不会显着变化。另外，我们已经确定的一些Runx1泛素化诱导分子可能包括调节Runx1功能而不是促进降解的分子。将来，我们将阐明单个分子引起的Runx1泛素化修饰的作用，并且我们还将使用基因组编辑技术来诱导Runx1泛素化酶的缺失，从而阐明其生理意义。