試験管内アッセイ系を用いたERAD(小胞体関連分解)の解析

小胞体で高次構造の形成に失敗した分泌タンパク質や細胞膜タンパク質は、ゴルジ体以降へ輸送されずに小胞体に留められ、サイトゾルのユビキチン・プロテアソーム系によって分解される。この分解系はERADと呼ばれており、小胞体の恒常性を維持するうえで、必須の役割を果たしている。本研究は、比較的研究が進んでいる構造異常タンパク質の認識のステップではなく、ERADの基質が小胞体膜を超えてサイトゾルへ輸送される逆行輸送のステップを解析することを目標としている。本研究の前段階として、我々は、複数回膜タンパク質を基質としたERADのin vitro系を独自に開発し、ERADの一連の反応の中で、膜タンパク質が小胞体膜からサイトゾルへ抽出されることを見出した。本研究では、同様の現象がin vivoでも起こりうる現象であるか調べるために、細胞レベルの解析を行った。細胞分画の方法を詳細に検討した結果、in vivoでも、12回膜貫通型のERADの基質が、ユビキチン化に依存して、サイトゾルへ抽出されている証拠を得ることに成功した。現在は、サイトゾルへ抽出された基質と相互作用している因子の同定、複合体の分子量を解析するとともに、小胞体膜のどの部分からサイトゾルへ抽出されているのか、in vitro系を用いた生化学的な解析を進めつつある。

小胞体で高次構造の形成に失敗した分泌タンパク質や細胞膜タンパク質は、ゴルジ体以降へ輸送されずに小胞体に留められ、サイトゾルのユビキチン・プロテアソーム系によって分解される。この分解系はERADと呼ばれており、小胞体の恒常性を維持するうえで、必須の役割を果たしている。本研究は、比較的研究が進んでいる構造異常タンパク質の認識のステップではなく、ERADの基質が小胞体膜を超えてサイトゾルへ輸送される逆行輸送のステップを解析することを目標としている。本研究の前段階として、我々は、複数回膜タンパク質を基質としたERADのin vitro系を独自に開発し、ERADの一連の反応の中で、膜タンパク質が小胞体膜からサイトゾルへ抽出されることを見出した。本研究では、同様の現象がin vivoでも起こりうる現象であるか調べるために、細胞レベルの解析を行った。細胞分画の方法を詳細に検討した結果、in vivoでも、12回膜貫通型のERADの基質が、ユビキチン化に依存して、サイトゾルへ抽出されている証拠を得ることに成功した。現在は、サイトゾルへ抽出された基質と相互作用している因子の同定、複合体の分子量を解析するとともに、小胞体膜のどの部分からサイトゾルへ抽出されているのか、in vitro系を用いた生化学的な解析を進めつつある。