蘇類Physcomitrella patens宿主・ベクタ-系の開発

1.Physcomitrella patens培養法の確立寒天培地はクノップ液を基本として、液体培地はMS培地にブドウ糖とクエン酸ソ-ダを添加して調製した。寒天培地上の原系体をブレンダ-で断片化したのち、液体培地に接種し、明所で攪拌しながら培養すると、10日後、植物体の重量は約50倍に達して増殖を停止した。液体培養では原系体の増殖が盛んで、組織分化はみられなかった。寒天培地へのオ-キシンの添加は原系体からロネマ及び芽への分化を促進し、サイトカイニンの添加は芽への分化を促進した。2.プロトプラストの形成法と再生法寒天培地上で生育した原系体を0.44Mマンニト-ル液に懸濁したのち、2%ドリセラ-ゼ処理によりプロトプラスト化ができた。生量1ー2gの原封体から約10^6ー10^7コのプロトプラストが形成された。プロトプラストを0.44Mマンニト-ル入りのクノップ液中で5日間23℃で培養後、毎日一度1/5量のクノップ液(マンニト-ルを含まない)を添加して、10日目に寒天平板に拡げ、さらに27℃で5日間保温したところコロニ-が形成された。再生途中の様子を顕微鏡観察したところ、先ず、球形の細胞の中央に隔壁ができ2細胞になり、その一方がさらに分列して原系体になることがわかった。3.エレクトロポレ-ションによる遺伝子の導入バイオラド社製のジ-ンパルサ-を用いて、プロトプラストの生存率が50%になる条件として、IμFで1200Vを設定した。nos,par,rulC,Ubiの各プロモ-タ-の下流にGUS遺伝子を連結したプラスミドをp.patensのプロトプラストに導入し、一過性のGUS活性を測定したところ、rulc,ubi,CaMv,nos,parの順にプロモ-タ-活性が強かった。

1.Physcomitrella patens培養法の確立寒天培地はクノップ液を基本として、液体培地はMS培地にブドウ糖とクエン酸ソ-ダを添加して調製した。寒天培地上の原系体をブレンダ-で断片化したのち、液体培地に接種し、明所で攪拌しながら培養すると、10日後、植物体の重量は約50倍に達して増殖を停止した。液体培養では原系体の増殖が盛んで、組織分化はみられなかった。寒天培地へのオ-キシンの添加は原系体からロネマ及び芽への分化を促進し、サイトカイニンの添加は芽への分化を促進した。2.プロトプラストの形成法と再生法寒天培地上で生育した原系体を0.44Mマンニト-ル液に懸濁したのち、2%ドリセラ-ゼ処理によりプロトプラスト化ができた。生量1ー2gの原封体から約10^6ー10^7コのプロトプラストが形成された。プロトプラストを0.44Mマンニト-ル入りのクノップ液中で5日間23℃で培養後、毎日一度1/5量のクノップ液(マンニト-ルを含まない)を添加して、10日目に寒天平板に拡げ、さらに27℃で5日間保温したところコロニ-が形成された。再生途中の様子を顕微鏡観察したところ、先ず、球形の細胞の中央に隔壁ができ2細胞になり、その一方がさらに分列して原系体になることがわかった。3.エレクトロポレ-ションによる遺伝子の導入バイオラド社製のジ-ンパルサ-を用いて、プロトプラストの生存率が50%になる条件として、IμFで1200Vを設定した。nos,par,rulC,Ubiの各プロモ-タ-の下流にGUS遺伝子を連結したプラスミドをp.patensのプロトプラストに導入し、一過性のGUS活性を測定したところ、rulc,ubi,CaMv,nos,parの順にプロモ-タ-活性が強かった。