ユビキチン・プロテアソーム系による酵母細胞機能制御の解析

出芽酵母の26Sプロテアソームの調節因子の構成成分の一つとして昨年までの研究で同定されたRpn9に関して遺伝学ならびに生化学からの研究を進めた。遺伝学的アプローチ:昨年までに、rpn9Δが温度感受性増殖を示すことを利用して多数の復帰突然変異体が分離されていた。今年度はこれらの復帰変異体を分類し、原因遺伝子のクローニングを開始した。一つの優性復帰突然変異はATPase遺伝子RPT3に生じたものであることを明らかにし、突然変異による塩基置換が保存領域SHR内にあることを突き止めた。他の優性変異遺伝子を遺伝的マッピングにより分類した。劣性の復帰変異についても変異遺伝子を染色体上にマッピングすることにより、ポジショナルクローニングを進めている。生化学的アプローチ:ヒト26Sプロテアソームの調節因子の新規構成成分p28の酵母ホモログ(Rpn13)を同定し、それに対する抗体を作製した。これを用いて、Rpn13が酵母のプロテアソームの構成成分であるかどうかを検討したところ、Rpn13は26Sプロテアソーム中には無いが、Rpt1と共沈するので、26Sプロテアソームの成熟段階にトランジエントに存在することが分かった。rpn9Δ株の抽出液をグリセロール濃度勾配遠心で分画した後、各分画を非変成ポリアクリルアミド電気泳動法により再分離すると、野生型と比べて成熟途中のプロテアソームが蓄積していることが分かった。この結果から、Rpn9は26Sプロテアソームの集合に関与することが予想された。

出芽酵母の26Sプロテアソームの調節因子の構成成分の一つとして昨年までの研究で同定されたRpn9に関して遺伝学ならびに生化学からの研究を進めた。遺伝学的アプローチ:昨年までに、rpn9Δが温度感受性増殖を示すことを利用して多数の復帰突然変異体が分離されていた。今年度はこれらの復帰変異体を分類し、原因遺伝子のクローニングを開始した。一つの優性復帰突然変異はATPase遺伝子RPT3に生じたものであることを明らかにし、突然変異による塩基置換が保存領域SHR内にあることを突き止めた。他の優性変異遺伝子を遺伝的マッピングにより分類した。劣性の復帰変異についても変異遺伝子を染色体上にマッピングすることにより、ポジショナルクローニングを進めている。生化学的アプローチ:ヒト26Sプロテアソームの調節因子の新規構成成分p28の酵母ホモログ(Rpn13)を同定し、それに対する抗体を作製した。これを用いて、Rpn13が酵母のプロテアソームの構成成分であるかどうかを検討したところ、Rpn13は26Sプロテアソーム中には無いが、Rpt1と共沈するので、26Sプロテアソームの成熟段階にトランジエントに存在することが分かった。rpn9Δ株の抽出液をグリセロール濃度勾配遠心で分画した後、各分画を非変成ポリアクリルアミド電気泳動法により再分離すると、野生型と比べて成熟途中のプロテアソームが蓄積していることが分かった。この結果から、Rpn9は26Sプロテアソームの集合に関与することが予想された。