膜結合性ATPoseからみたリソゾ-ムとペルオキシゾ-ムの蛋白質輸送機構

从膜结合ATPose角度探讨溶酶体和过氧化物酶体中的蛋白质转运机制

• 批准号: 03264208
• 负责人: 大熊 勝治
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03264208/
• 关键词: リソゾ-ム; ペルオキシゾ-ム; プロトン・ポンプ; ATPase; 再構成; cDNAクロ-ニング; クロフィブレ-ト

リソゾ-ム膜より,Mono Qカラム及びTSK‐gel G4000SW_<XL>を用いてH^+ーATPaseを精製することに成功.本酵素はSDSーPAGEで空胞系H^+ーATPaseに共通にみられるサブユニット構造を示し,至適pHは7.0ー8.0、CI^-,Br^-,F^-が活性化し、NO_3^-は強く阻害した。また,16kDaサブユニットに対するcDNAの単離,抗16kDa抗体の調製にも成功した。単クロ-ン抗体も調製できたが,インムノブロットには成功していない。更に,可溶化H^+ーATPaseを希釈法でリポソ-ムに組み込み,プロトン・ポンプ再構成に成功した。一方,ATPaseII(360kDa)と細胞膜上のectoーATPaseの両者を単離して比較した結果,至適pHとCa^<2+>/Mg^<2+>要求性が若干異なるものの,その他の性質(二価金属要求性,基質特異性,薬剤感受性等)は両酵素で極めて類似していることが確認された。しかし,NEM感受性のATPaseI(550kDa)共々リソゾ-ムの内部に存在することが判明,顆粒運動(キネシン様ATPase),膜融合(NSF),蛋白質輸送との関係は否定された。一方,クロフィブレ-トを投与したラットの肝臓ペルオキシゾ-ム膜上には,NEM感受性ATPaseとNEM非感受性ATPaseの2種類のATPase活性が誘導される。 NEM感受性ATPase(520kDa)はATPに対するKm値が780μMで,DIDS,STA,DCCD,TBT,quercetinに感受性を示した。一方のNEM非感受性ATPase(450kDa)は,STA以外の阻害剤に非感受性であった。NEM感受性ATPase(約270ー360kDa)はproteinaseーK耐性であり,また, NEM感受性ATPaseも抗PMP70IgGにより免疫沈降できないことから,両ATPaseともPMP70とは異なることが判明した。NEM感受性ATPaseはその薬剤感受性から基質輸送に働いている可能性が高い。これらのATPaseのが蛋白質の輸送に如何に関与するか,今後その可能性を明らかにしていきたい。

TSK‐gel G4000SW_<XL>SDS PAGE showed that H^+-ATPase had a common structure and was activated at pH 7.0 - 8.0, Cl ^-,Br^-,F^-, NO_3^-and strongly inhibited. In addition,16kDa protein was successfully isolated from cDNA, and the modulation of anti-16kDa antibody was successfully performed. The antibody modulation was successful. In addition, solubilized H^+ ATPase was successfully reorganized in a variety of ways. On the one hand,ATPaseII(360kDa) and the enzyme on the cell membrane were separated and compared. The results showed that there were some differences in pH and Ca^&lt;2+&gt;/Mg^&lt;2+&gt; requirements, and other properties (metal requirements, substrate specificity, drug sensitivity, etc.) were confirmed. In addition, the relationship between ATPaseI(550kDa),NEM receptor, and protein transport was identified. On the other hand, two kinds of ATPase activities,NEM sensitive ATPase and NEM non-sensitive ATPase, were induced on the membrane. NEM-sensitive ATPase(520kDa) showed sensitivity to ATP,DIDS,STA,DCCD,TBT,quercetin, and Km values of 780μM. One side of NEM non-susceptible ATPase(450kDa) is resistant to STA. NEM-sensitive ATPase(about 270 - 360kDa) is resistant to protease K, and NEM-sensitive ATPase is resistant to PMP70IgG. NEM sensitivity is higher than that of ATPase sensitivity and substrate transport. How this ATPase is related to protein transport and how it might be possible in the future

项目成果

Junーichi Nezu: "Molecular cloning of a rat liver cDNA encoding the 16 kDa subunit of vacuolar H^+ーATPases: organellar and tissue distribution of 16 kDa proteolipids" J.Biochem.111. (1992)

Junichi Nezu：“编码液泡 H+-ATP 酶 16 kDa 亚基的大鼠肝脏 cDNA 的分子克隆：16 kDa 蛋白脂质的细胞器和组织分布”J.Biochem.111（1992）。

Kunizo Arai: "Isolation of highly purified Iysosomes from rat liver: identification of electron carrier components on lysosomal membranes" J.Biochem.110. 541-547 (1991)

Kunizo Arai：“从大鼠肝脏中分离高度纯化的溶酶体：溶酶体膜上电子载体成分的鉴定”J.Biochem.110。

Hiroーomi Tamura: "Induction of neurite outgrowth of PC12 cells by an inhibitor of vacuolar H^+ーATPase,bafilomycin A_1" FEBS Lett.294. 51-55 (1991)

Hiroomi Tamura：“液泡 H^+ーATP 酶抑制剂巴弗洛霉素 A_1 诱导 PC12 细胞的神经突生长”FEBS Lett.294 (1991)。