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Lysosome H^+-ATPaseの分子構築に関する生化学的・免疫化学的研究

溶酶体H^+-ATP酶分子结构的生化和免疫化学研究

基本信息

批准号：
62580156
负责人：
大熊勝治
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Teikyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1987
资助国家：
日本
起止时间：
1987 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-62580156/
关键词：
ラット肝臓リソゾーム Lysosome プロトンポンプ H^+-ATPase Triton-X-114 C_<12>E_9

项目摘要

Lysosome H^+-ATPaseは NEM感受性, oligomycinやefrapeptinに耐性, bicarbonateによって活性化されない, 等の点でmitochondriaのF_0F_1-ATPase(MF_0F_1)とは明らかに異なっているが, その他の諸性質はMF_0F_1と極めて類似しており, 本ATPaseの精製が極めて困難な理由になっている. 先ず, ラット肝tritosomeより本H^+-ATPaseを部分精製したが, nemに強い感受性を示すと同時にoligomyoinやbicarbonateに対する感受性も上昇し, 抗F_1β抗血清を用いたimmunablotでも, 48Kの蛋白が染色され, MF_0F_1の混入が多いことが分かった. そこで, MF_0F_1を切除する方法を検討した. 先ず, Triton X-114で, MF_0F_1を選択的に可容化・除去出来ることが抗F1β抗血清によるimmunoblotの他efrapeptin感受性・bicarbonateによる活性化等の指標で確認された. しかしながら, Triton X-114処理後 H^+ATPaseの可容化が極めて困難になった.そこで, これに代わる可容化剤を検討した結果, C_<12>E_9によりこの問題点が解決された. 即ち, ラット肝tritosomeの膜ghostを, 10%glycerol及び200μg/ml・phosphatidylcholine存在下に0.5%C_<12>E_9で抽出すると, lysosome H^+・ATPaseを優先的に抽出できた. 更にhydroxylapatiteによる吸着やglycerol密度勾配遠心によって, MF_0F_1より分子サイズの小さいATPaseとして回収できた. C12E9抽出標品を0/02%O_<12>E_9存在下に末変性acrylamide密度勾配disc電気泳動後, 活性染色すると, MF_0F_1よりも移動度の大きなバント(見かけの分子量=40万弱)としてlysosomeのH^+-ATPaseを固定できた.以上の結果より, lysosome H^+-ATPaseはMF_0F_1とは全く異なる構造のATPaseであることが示唆された. 現在, H^+ATPaseに対するmonoclonal抗体の作製に鋭意取り組んでいるが, 通常の方法では調製困難であることもはっきりしてきた. 各種方法を組み合わせて, lysosome H^+-ATPaseの構造の解明を早急に果たしたいと考えている.

Lysosome H^+-ATPase is NEM sensitive, oligomycin, efraptin tolerant, bicarbonate active, mitochondria F_0F_1-ATPase(MF_0F_1) active, MF_0F_1 similar to other properties, and the purification of this ATPase is extremely difficult. The H^+-ATPase was partially purified and showed strong sensitivity to nem, while the sensitivity to oligomyosin and bicarbonate increased. The anti-F_1 β antiserum was used in immunablot. The 48K protein was stained and MF_0F_1 was mixed in. The method of MF_0F_1 removal is discussed. In the first place, Triton X-114, MF_0F_1, F1β, F1β, F After treatment with Triton X-114, it was very difficult to accommodate H^+ATPase. C_<12>E_9 is the solution to this problem. In the presence of 0.5%C_ E_9, lysosome H^+·ATPase was preferentially extracted in the presence of 10%glycerol and 200μg/ml·phosphatidylcholine<12>. In addition, the hydroxyl apatite is adsorbed by glycerol, and the density of glycerol is matched with that of the remote center. MF_0F_1 is a molecular enzyme. C12E9 extract standard 0/02%O_E_9 <12>density of the final acrylamide coupled with disc electrophoresis, activity staining, MF_0F_1. As a result, lysosome H^+-ATPase is MF_0F_1 and its structure is completely different. Now, H^+ATPase in the production of monoclonal antibodies in the determination of the group, the usual method is difficult to modulate. A variety of methods were used to investigate the structure of lysosome H^+-ATPase.