リソゾ-ム膜上のH^±ATPaseと2種の新規ATPaseーその構造と機能に関する生化学的研究

H^±ATP酶和溶酶体膜上的两种新的ATP酶：其结构和功能的生化研究

• 批准号: 03671047
• 负责人: 大熊 勝治
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03671047/
• 关键词: リソゾ-ム; プロトン・ポンプ; cDNAクロ-ニング; 再構成; 単クロ-ン抗体; ATPase; イオン・チャンネル

リソゾ-ム膜より,Mono Qカラム及びTSKーgel G4000SW_<XL>を用いてH^+ーATPaseを精製することに成功した。本酵素はSDSーPAGEで空胞系H^+ーATPーaseに共通にみられる(110),70,56,42,39,34,16kDaのサブユニット構造を示した。至適pHは7.0ー8.0、ATPに対するKm値は0.095mM、基質特異性はATP,dATP>GTP,ITP>UTPで、CTP,AMP,cAMPは無効,ADPは阻害した。二価金属要求性はMg^<2+>,Mn^<2+>>Fe^<2+>,Co^<2+>>Ca^<2+>で,Sr^<2+>,Ba^<2+>は無効、Cu^<2+>,Pb^<2+>,Zn^<2+>,Hg^<2+>,Cd^<2+>,Ni^<2+>は阻害した。Cl^ー,Br^ー,F^ーが活性化し、NO_3^ーは強く阻害した。bafilomycin A_1の他、NEM,NBDーCl,DCCSに感受性であった。また,16kDaサブユニットに対するcDNAの単離,抗16kDa抗体の調製にも成功,これらプロ-ブを用いた検討の結果,16kDa蛋白は腎臓と脳で極めて発現が高いこと,その遺伝子は複数存在することを明らかにできた。単クロ-ン抗体も調製できたが,インムノブロットには成功していない。更に,可溶化H^+ーATPaseを希釈法でリポソ-ムに組み込み,プロトン・ポンプ再構成に成功した。この過程で,リソゾ-ム膜上にK^+及びCl^ーに対するイオンチャンネルが存在することを示唆する結果を得た。H^+ーATPase以外の2種のATPaseについてもその性質を明らかにした。ATPaseII(360kDa)と類似のATPaseは,細胞膜上にectoーATPsaeとして存在する。両ATPaseを単離して比較した結果,至適pHとCa^<2+>/Mg^<2+>要求性が若干異なるものの,その他の性質(二価金属要求性,基質特異性,薬剤感受性<酸性でバナジン酸感受性>等)は両酵素で極めて類似していることが確認された。NEM感受性のATPaseI(550kDa)は,ATPaseII共々リゾソ-ムの内部に存在することが判明,顆粒の細胞内運動に関係したキネシンや膜融合に関与するNSFとの関係は否定された。

"Mono", "Mono Q" and "TSK", "gel G4000SWT", "LTX", "LTX", "H^" + "ATPase", and "success". This enzyme "SDS" PAGE "empty cell line H^ +" ATP "ase" shares the same level of activity. Until pH 7.0

项目成果

Hiroーomi Tamura: "Induction of neurite outgrowth of PC12 cells by an inhibitor of vacuolar H^+ーATPase,bafilomycin A_1" FEBS Lett.294. 51-55 (1991)

Hiroomi Tamura：“液泡 H^+ーATP 酶抑制剂巴弗洛霉素 A_1 诱导 PC12 细胞的神经突生长”FEBS Lett.294 (1991)。

Junーichi Nezu: "Molecular cloning of a rat liver cDNA encoding the 16 kDa subunit of vacuolar H^+ーATPases: organellar and tissue distribution of 16 kDa proteolipids" J.Biochem.111. (1992)

Junichi Nezu：“编码液泡 H+-ATP 酶 16 kDa 亚基的大鼠肝脏 cDNA 的分子克隆：16 kDa 蛋白脂质的细胞器和组织分布”J.Biochem.111（1992）。

Kunizo Arai: "Isolation of highly purified lysosomes from rat liver:identification of electron carrier components on lysosomal membranes" J.Biochem.110. 541-547 (1991)

Kunizo Arai：“从大鼠肝脏中分离高度纯化的溶酶体：溶酶体膜上电子载体成分的鉴定”J.Biochem.110。