カイコ前胸腺刺激ホルモンのNMRによる立体構造解析と機能相関

蚕前胸激素的NMR结构分析及功能相关性

• 批准号: 08276218
• 负责人: 永田 宏次
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08276218/
• 关键词: 前胸腺刺激ホルモン; 立体構造解析; 結晶化; 脱皮; 変態; 昆虫

カイコ前胸腺刺激ホルモン(PTTH)の分子量は活性に不要な糖鎖を除いて約25kDaであり、多次元NMR法を用いても立体構造決定が容易でないこと、および、現在までの決定されているシスチンノットファミリーの立体構造はすべてX線結晶解析法により解かれていることから、PTTHの立体構造解析法としてX線結晶解析法の方が妥当であると判断し、PTTHの結晶化の条件検討を散在行列(sparse matrix)法により進めた。結晶化条件検討キットCrystal Screen (Hampton Research)を用いて50種類の塩緩衝液・沈殿剤の組み合わせのもとで初期スクリーニングを行い、いくつかの条件下で微結晶を得ることができた。特に、緩衝液としてNaHepes pH7.5、沈殿剤としてPEG4000あるいはNa citrateを用いた場合に最良の結果が得られた。今後、結晶化条件を精密化することにより、構造解析に用いる質の高い結晶が得られると期待される。また、結晶化に用いる試料タンパク質の安定供給のために、新たに発現系を構築した。6xHis融合カイコPTTHを大腸菌で発現し、封入体を6M尿素で可溶化後、Ni^<2+>固定化樹脂で精製した。この特異的親和性を利用する簡便な精製により大量の組み換えPTTHを安定して調製できるようになった。この方法により得られた組み換えPTTHを用いて、従来よりも効率良く結晶化の条件の精密化を進めることが可能になった。

カ イ コ thymus before stimulus ホ ル モ ン (PTTH) の は molecular weight active に don't な sugar lock を except い て about 25 kda で あ り, multidimensional NMR method を い て も three-dimensional structure decision が easy で な い こ と, お よ び, now ま で の decided さ れ て い る シ ス チ ン ノ ッ ト フ ァ ミ リ ー の three-dimensional structure は す べ て X-ray crystal analytic method に よ り solution か れ て い る こ と か ら, PTTH の three-dimensional structure analytic method と し て X-ray crystal analytic method の party が appropriate で あ る と judgment し, PTTH の crystallization 検 の conditions for を scattered ranks (sparse matrix) method に よ り into め た. 検 crystallization conditions for キ ッ ト Crystal Screen (Hampton Research) を with い て 50 kinds の salt buffer, Shen Dian tonic の group み close わ せ の も と で early ス ク リ ー ニ ン グ を い, い く つ か の conditions で micro crystalline を very る こ と が で き た. に, buffer と し て NaHepes pH7.5, Shen Dian tonic と し て PEG4000 あ る い は Na citrate を with い に た occasions the result of the ideal の が ら れ た. In the future, the crystallization conditions will be を refined する とによ とによ <e:1>, and the structural analysis will に use <s:1> る high-quality <s:1> crystallization が to achieve られると expectations される. ま た, crystallization に with い る sample タ ン パ ク qualitative の stable supply の た め に, new た に 発 now is を build し た. 6xHis fusion カ コPTTHを escherichia coli で occurrence た inclusion body を6M urea で can be dissolved, Ni^<2+> immobilization resin で refined た. Simple こ の specific affinity を using す る な refined に よ り み in large Numbers of の え PTTH を settle し て modulation で き る よ う に な っ た. こ の way に よ り have ら れ み た group in え PTTH を with い て, 従 よ り も く sharper rate good crystallization conditions の の motors を into め る こ と が may に な っ た.