In-cell NMRによる真核細胞内蛋白質の立体構造解析法の開発

开发使用细胞内 NMR 进行真核蛋白质 3D 结构分析的方法

• 批准号: 21200044
• 负责人: 伊藤 隆
• 金额: $ 19.39万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research a proposed research project)
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21200044/
• 关键词: in-cell NMR; 蛋白質; 高次構造; 真核細胞; ヒト培養細胞; 分裂酵母; 培養昆虫細胞; アフリカツメカエル卵細胞; アフリカツメカエル卵母細胞

最近,細胞内のMolecular Crowdingが蛋白質動態に及ぼす影響が議論され始めており,蛋白質の機能を理解するためには,生細胞中での詳細な「その場観察」が必須であると考えられるようになって来た.その手段としてin-cell NMRが注目されている.本研究では,進化しつつあるin-cell NMR測定技術の次の大きな目標として,「真核細胞」における蛋白質の立体構造解析を可能にする方法論的研究・開発を行う.蛋白質が実際に機能している場である生きた真核細胞における世界初の蛋白質分子の立体構造決定を目指し,in-cell NMRを用いた新しい解析手法の開発研究を行うことを目的とする.H22年度の研究実績は以下の通りである.分裂酵母のin-cell NMRについては,分裂酵母内在の蛋白質Hsp9について,予備的なin-cell NMR測定とin vivoでのNMR解析を行った.培養昆虫細胞Sf9のin-cell NMRについては,連鎖球菌protein G B1ドメイン(GB1)と高度好熱菌TTHA1718の発現系を作成し,Sf9における良好な蛋白質発現を達成した.このうちGB1については,in-cell NMRを用いて良好な^1H-^<15>N HSQCスペクトルを得ることに成功した.真核細胞内で発現させた蛋白質のin-cell NMR測定例としては世界初となる.HeLa細胞の系では,TTHA1718を用いて,細胞内蛋白質の詳細な解析のために必要な3D triple- resonance NMR測定のための予備的なin-cell NMR測定を行い,良好な結果を得た.

Recently, intracellular の Molecular Crowding が protein dynamic に and ぼ す talk affect が さ れ beginning め て お り, function of protein の を understand す る た め に は, living cells で の detailed な "そ の 観 examine" が must で あ る と exam え ら れ る よ う に な っ て た. そ の means と し て in the cell NMRが pay attention to されて る る. This study で は, evolution し つ つ あ る - cell in NMR measurement technology の の times large き な target と し て, "eukaryotic cells" に お け の る protein three-dimensional structure resolution を may に す る methodology research, open 発 う を line. Function of protein が be interstate に し て い る field で あ る raw き た eukaryotic cells に お け る の の three-dimensional structure of protein molecules at the beginning of the world decided を refers し, - cell in NMR を with い た new し い parsing technique の open 発 を line う こ と を purpose と す る. H22 annual の research be performance under は の tong り で あ る. Split yeast の - cell in NMR に つ い て は, split inner の yeast protein Hsp9 に つ い て, to prepare な - cell in NMR measurement と in vivo で の NMR analytical line を っ た. Cultivate insect Sf9 cells の - cell in NMR に つ い て は, chain coccus protein G B1 ド メ イ ン (GB1) と highly hot bacteria TTHA1718 の 発 now is を し consummate, Sf9 に お け る な protein 発 を now achieve good し た. こ の う ち GB1 に つ い て は, - in the cell NMR を with い て な good ^ - ^ 1 h < 15 > N HSQC ス ペ ク ト ル を must る こ と に successful し た. Eukaryotic cells で 発 now さ せ た protein の - cell in NMR measurement example と し て は early world と な る. HeLa の is で は, TTHA1718 を with い て, intracellular protein の detailed analytical の な た め に な necessary 3 d triple - resonance NMR assays ため ため The prepared なin-cell NMR assays を rows ため, good な results を た.

项目成果

In-cell NMR studies of protein structure and dynamics inside living cells

活细胞内蛋白质结构和动力学的细胞内核磁共振研究

• 发表时间: 2010
• 作者: 中井陽一;日高宏;渡部直樹;小島隆夫;水野真木子;伊藤隆
• 通讯作者: 伊藤隆

NMR protein structure determination in living E. coli cells using nonlinear sampling

• DOI: 10.1038/nprot.2010.69
• 发表时间: 2010-01-01
• 期刊: NATURE PROTOCOLS
• 影响因子: 14.8
• 作者: Ikeya, Teppei;Sasaki, Atsuko;Ito, Yutaka
• 通讯作者: Ito, Yutaka

Structure and dynamics of proteins at work inside cells

细胞内工作蛋白质的结构和动力学

• 发表时间: 2010
• 作者: 伊藤隆

非線形サンプリングによる迅速な多次元NMR測定法

使用非线性采样的快速多维核磁共振测量方法

• 发表时间: 2010
• 作者: 伊藤隆

Solution structure of a zinc-finger domain that binds to poly-ADP-ribose

• DOI: 10.1111/j.1365-2443.2009.01369.x
• 发表时间: 2010-02-01
• 期刊: GENES TO CELLS
• 影响因子: 2.1
• 作者: Isogai, Shin;Kanno, Shin-Ichiro;Shirakawa, Masahiro
• 通讯作者: Shirakawa, Masahiro