In-cell NMRによる真核細胞内蛋白質の立体構造解析法の開発

开发使用细胞内 NMR 进行真核蛋白质 3D 结构分析的方法

基本信息

批准号：
21200044
负责人：
伊藤隆
金额：
$ 19.39万
依托单位：
Tokyo Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research a proposed research project)
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

最近,細胞内のMolecular Crowdingが蛋白質動態に及ぼす影響が議論され始めており,蛋白質の機能を理解するためには,生細胞中での詳細な「その場観察」が必須であると考えられるようになって来た.その手段としてin-cell NMRが注目されている.本研究では,進化しつつあるin-cell NMR測定技術の次の大きな目標として,「真核細胞」における蛋白質の立体構造解析を可能にする方法論的研究・開発を行う.蛋白質が実際に機能している場である生きた真核細胞における世界初の蛋白質分子の立体構造決定を目指し,in-cell NMRを用いた新しい解析手法の開発研究を行うことを目的とする.H22年度の研究実績は以下の通りである.分裂酵母のin-cell NMRについては,分裂酵母内在の蛋白質Hsp9について,予備的なin-cell NMR測定とin vivoでのNMR解析を行った.培養昆虫細胞Sf9のin-cell NMRについては,連鎖球菌protein G B1ドメイン(GB1)と高度好熱菌TTHA1718の発現系を作成し,Sf9における良好な蛋白質発現を達成した.このうちGB1については,in-cell NMRを用いて良好な^1H-^<15>N HSQCスペクトルを得ることに成功した.真核細胞内で発現させた蛋白質のin-cell NMR測定例としては世界初となる.HeLa細胞の系では,TTHA1718を用いて,細胞内蛋白質の詳細な解析のために必要な3D triple- resonance NMR測定のための予備的なin-cell NMR測定を行い,良好な結果を得た.

最近，已经开始讨论细胞内分子拥挤对蛋白质动力学的影响，并且活细胞中的原位观察结果对于了解蛋白质的功能至关重要。内部NMR作为一种手段引起人们的注意。在这项研究中，进化内NMR测量技术的下一个主要目标是进行方法论研究和开发，从而能够分析真核细胞中蛋白质构象。目的是使用内部NMR开发和研究新的分析方法，旨在确定世界上蛋白质实际发挥作用的世界上第一个蛋白质分子结构。 2000年的研究结果如下。关于裂变酵母中的细胞内NMR，我们具有用于内部酵母内蛋白质HSP9的核内NMR的初步NMR。进行了NMR测量和体内NMR分析。对于培养昆虫细胞SF9的细胞内NMR，创建了用于链球菌蛋白G B1结构域（GB1）的表达系统，并创建了高度嗜热细菌TTHA1718，并在SF9中实现了良好的蛋白表达。其中，使用单元内NMR成功获得了GB1以获得良好的 ^1H - ^<15> N HSQC频谱。这是世界上表达在真核细胞中表达的蛋白质内NMR内NMR测量的第一个例子。在HeLa细胞系统中，TTHA1718用于对3D三谐和NMR测量进行初步内部NMR测量，以详细分析细胞内蛋白，并获得良好的结果。