リボザイムの生体での機能発現

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1.線虫C.elegansのunc-22mRNA上の3つの部位に対して、それぞれ6+6、8+8、10+10塩基対合をし得るハマーヘッド型リボザイム計9種類を作製し、短い基質RNAの切断活性をin vitroで調べた。37℃においては、全くのリボザイムが予想される部位を触媒的に切断し、その活性は部位33、39については高く、部位6については低かった。また、部位33、39について活性の強さは、8+8>10+10>6+6の順であった。20℃においては6+6リボザイムの活性が相対的に最も高かった。2.部位39に対する10+10塩基対合のヘアピン型リボザイムにつき、ステム部分及びステム、ループ双方をより安定性が高いと予想される配列に変えたリボザイムを調製した。これらはinvitroにおいていづれも活性があり、前記のものとの比較を行っている。また、unc-22mRNAの2つの部位(39,55)に対して(-)sTRSV触媒部位の構造に基づくヘアピン型リボザイムを調製して、対応する基質RNAの切断活性をin vitroで調べた。37℃において部位55について切断活性が見られた。3.リボザイムをC.elegans中で発現させるためのベクターをいくつか構築あるいは入手し、lac Z遺伝子を組み込んでその発現によってC.elegans中での発現をテストした。その結果、筋肉ミオシン重鎖遺伝子unc-54のプロモーター/エンハンサーを持つ改良型(短鎖転写型)ベクターが体壁筋中でのlacZの発現に適していることが明かとなった。またこのベクターにunc-22アンチセンス遺伝子を組み込んで導入したところ、Unc-22(-)の表現型を示す形質転換体が得られた。4.上記ベクターに前述の9種のハマーヘッドリボヅイムの遺伝子それぞれを挿入し、これらプラスミド単独または混合物をC.elegan街に微量注入した。J1または安定な形質転換体がいくつか得られたが、現在までに20℃においてUns-22(-)の表現型を示すものは得られていない。5.ラット菌養細胞HY1について、GsαmRNA及びGsαタンパクの存在を逆転-PCR法及び抗体によるウェスタン法によりそれぞれ確認した。6.GsαmRNAの翻訳開始部位等に相補的な20merのオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、リポフェクチン等によるHY1細胞へのとり込みを調べている。