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心臓異常電気活動の発生に関与する電位依存性K^+チャンネルの分子生物学的研究

电压门控 K^+ 通道参与异常心电活动产生的分子生物学研究

基本信息

批准号：
04248213
负责人：
松原弘明
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kansai Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.遅延整流型K^+チャネル(KV1.5)全遺伝子構築と転写調節機序:我々が単離したKV1.5のcDNA断片をプローブとしてラット全遺伝子ライブラリーより約18Kbの長さのクローンを単離した。Southern blot法により制限酵素地図を作製し上流・下流の塩基配列を決定した。Primer extension法およびPCRを用いたrapid amplificaion of 5'cDNA end(RACE)法を利用しこの遺伝子はintronlessでsingle exonとして存在し3カ所の転写開始点を持った。上流部には典型的TATAやCAAT配列はなくこれが心筋での低発現量や複数の転写開始点を説明すると考えられた。一方、上流域にはTGACGTCAから成るcAMP response element(CRE)が存在したため我々は新生児ラット培養心房細胞を作製しKV1.5mRNA量に対するcAMPの影響を検討した。dibutyryl cAMP(1mM)添加後1時間より有意増加があり4時間後には約4倍の頂値を取り以後漸減した。cMAPの刺激がCREを介する転写段階で働く事を検討するためCREを含む上流域と含まない上流域をCAT reporter geneに連絡しC2C12筋細胞に導入しcAMP効果をしらべると後者ではcAMPによるCAT活性の刺激は観察されなかった。現在in vito mutagenesisでmutationをCRE内に作成しさらに詳細にこのmotifの役割を検討中である。2.A type K^+チャネル(KV1.4)遺伝子のmRNA調節:KV1.5遺伝子がcAMPで転写調節される事はK^+チャネルの発現が恒常状態にない事を示唆する。我々は新生児ラット培養心室細胞を利用しRT-PCR法にてKV1.4のmRNA量の調節を検討した。cAMP上昇はmRNA量に変化を与えないがBAY-K8644およびTPAにより約3倍上昇した。これらの結果は細胞内Ca^<++>上昇およびprotein kinase C活性化がKV1.4発現に重要でありKV1.5のcAMPによる調節と合わせて心筋Shaker K^+ channelsの発現は復雑である事を示唆する。

1. The cDNA fragment of KV1.5 was isolated from the cDNA fragment of KV1.5. The length of the cDNA fragment was about 18Kb. Southern blot method to limit enzyme activity in the upper and lower streams Primer extension method and PCR method are used in rapid amplification of 5'cDNA end(RACE) method. A typical TATA/CAAT arrangement in the upper stream is illustrated by a description of the low emission and multiple writing start points of the central tendon. To investigate the effects of TGACGTCA on cAMP response element(CRE) production in cultured neonatal atrial cells. dibutyryl cAMP(1mM) increased intentionally 1 time after addition and decreased gradually 4 times after addition cMAP stimulation is mediated by CRE, CAT reporter gene is contained in the upper part of the river, CAT reporter gene is contained in the upper part of the river, and CAT activity is detected in the lower part of the river. Now in vito mutation CRE made in detail 2. mRNA regulation of A type K^+ cAMP gene (KV1.4): mRNA regulation of KV1.5 cAMP gene. We investigated the regulation of KV1.4 mRNA in neonatal cultured ventricular cells by RT-PCR. cAMP increased by about 3 times compared with BAY-K8644 and TPA. This results in an increase in intracellular Ca^++> and protein kinase C activation, which are important for the development of KV1.4, and the regulation of cAMP in KV1.5, which are important for the development of Shaker K^+ channels.