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血小板由来血管内細胞増殖因子の生理的意義の解析

血小板源性血管内细胞生长因子的生理意义分析

基本信息

批准号：
04263217
负责人：
豊島秀男
金额：
$ 1.6万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

PD-ECGFを産生することが明かにされている扁平上皮癌細胞株A431を ^<32>P正燐酸でラベルしその可溶化分画の抗PD-ECGF抗体を用いた免疫沈降法で分析したところ、PD-ECGFも燐酸化されていることが明かにされた。燐酸化アミノ酸分析の結果、セリン残基が燐酸化されていた。TPA、EGF、forskolinなどの刺激でPD-EGCGの燐酸化には変化がみられなかった。一方、SDS、Mg^<2+>、DTT存在下でPD-ECGFはin vitroで燐酸化された。PD-ECGFのアミノ酸配列にヌクレオチド結合モチーフがあるので、[2,5′- ^3H]、[2,5′,8- ^3H]、[a- ^<32>P]、[g- ^<32>P]ATPとPD-ECGFをインキュベートしたところPD-ECGFはいずれの放射性ATP同位体でもラベルされ、PD-ECGFにはATPが結合していると考えられた。[a- ^<32>P]、[g- ^<32>P]ATPでラベルしたPD-ECGFの燐酸化アミノ酸分析の結果[g- ^<32>P]ATPでラベルしたPD-ECGFにのみ ^<32>P燐酸化セリンのスポットが得られ、PD-ECGFのセリン残基はATPのg位の燐酸とエステル結合していると考えられた。更に、in vivoで ^<32>P正燐酸でラベルしたPD-ECGFのヌクレオチド分析の結果,in vivoでもPD-ECGFはヌクレオチドと結合していることが明らかにされた。最近、大腸菌のthymidine Phosphorylaseが同定され、PD-ECGFとアミノ酸レベルで39.2%のホモロジーがあることが明かにされた。thymidine phosphorylaseは正燐酸存在下にチミジンをチミンとデオキシリボース燐酸に分解またはその逆を行なう酵素で、精製結晶化されX線解析によってthymidine/thymine結合部位やリボース結合部位などの機能ドメインが明かにされているが、ヒトPD-ECGFのアミノ酸配列でもそれらはすべて保存されていた。そこでレコンビナントヒトPD-ECGFを用いてthymidine phosphorylaseアッセイを行った結果、PD-ECGFは極めて高い活性を持つことが明かにされた。大腸菌のthymidine phosphorylaseは分子量45000のサブユニットが非共有結合でホモダイマーを形成しているが、レコンビナントヒトPD-ECGFを用いたゲル渡過解析によってPD-ECGFもthymidine phosphorylaseと同様に分子量90000のホモダイマーであることがあきらかにされた。PD-ECGFのthymidine phosphorylase活性が ^3Hチミジン取込みアッセイに何らかの影響を与えている可能性が考えられ、詳細な検討の結果PD-ECGFによる ^3Hチミジンの取込み促進はPD-ECGFのthymidine phosphorylase活性による培地中のチミジンの分解のため ^3Hチミジンの放射性比活性があがったことによるものと考えられた。PD-ECGFはin vitroでchemotaxisを促進しin vivoではangiogenesisを起こすが、アデニン、ニコチンアミド、ADPなどが血管新生促進作用を持ちまたヌクレオチドは白血球などのchemotaxisに関与することから、それらの活性はthymidine phosphorylase活性による間接的なものである事が示唆された。

PD-ECGF production and phosphorylation were analyzed by immunoprecipitation in squamous cell carcinoma cell line A431<32>. The results of phosphorylation analysis showed that the phosphorylated residues were not detected. TPA, EGF and forskolin stimulate PD-EGCG phosphorylation. PD-ECGF is not in vitro phosphorylated in the presence of SDS, Mg^<2+> and DTT. PD-ECGF is an active acid ligand,[2,5′- ^3H],[2,5′, 8- ^3H],[a- ^<32>P],[g- ^<32>P]ATP and PD-ECGF. PD-ECGF is an active ATP isomer. PD-ECGF is an ATP ligand. [a-^<32>P],[g-^<32>P] ATP,[g] ATP,[<32><32>g] ATP,[g In addition, in vivo<32>, PD-ECGF analysis results of orthophosphoric acid were analyzed. In vivo, PD-ECGF analysis results were analyzed. Recently, thymidine phosphatase in Escherichia coli has been identified, and PD-ECGF has been identified by 39.2% of the total. In the presence of orthophosphate, thymidine phosphorylase is used to decompose phosphate and reverse the process of enzyme, purification and crystallization. X-ray analysis is used to analyze thymidine/thymine binding site, and function of thymidine binding site. PD-ECGF is used to prepare acid. PD-ECGF is used for thymidine phosphorylase activation. PD-ECGF has high activity. Escherichia coli thymidine phosphorylase molecular weight of 45000 to form the PD-ECGF molecular weight of 90000 to form the PD-ECGF molecular weight of 45000 to form the PD-ECGF molecular weight of 90000 to form the PD-ECGF molecular weight of 9000 to form the PD-ECGF molecular weight 900 to form the PD-ECGF molecular weight 9 PD-ECGF thymidine phosphorylase activity in the culture medium of the decomposition of thymidine phosphorylase activity in the culture medium of PD-ECGF radioactivity specific activity in the culture medium of the decomposition of thymidine phosphorylase activity in the culture medium of PD-ECGF. PD-ECGF promotes chemotaxis in vitro and angiogenesis in vivo, and the angiogenesis-promoting effects of Adenine, Nekonin, and ADP are related to the chemotaxis of white blood cells, and their activities are indirectly related to thymidine phosphorylase activity.