家族性筋萎縮性側索硬化症におけるSOD1の構造及び機能解析

家族性肌萎缩侧索硬化症中 SOD1 的结构和功能分析

• 批准号: 09280216
• 负责人: 佐古田 三郎
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09280216/
• 关键词: 家族性筋萎縮性側索硬化症; 銅; Thioredoxin; superoxide dismutase; 赤血球

常染色体優性遺伝を示す家族性筋萎縮性側索硬化症(fALS)患者のhemolysateより抗ヒトSuperoxide dismutase-1(SOD-1)ポリクローナル抗体を用いて得た免疫沈降物を、液体クロマトグラフィー/質量分析計(HPLC-ESI/MS)で解析することで、正常および変異SOD-1蛋白を識別した。その結果、変異SOD-1蛋白の存在を確認できる安定型(G37R,H46R等)と全く存在を確認できなかった不安定型(I149T,126L 2塩基欠失等)に分類された。次に、脆弱な変異SOD-1蛋白の特性を調べるために、患者赤血球中よりSOD-1蛋白の精製を試みた。CM-52セルロースでヘモグロビンを吸着させたサンプルをDE-52セロル-スに添加し、NaCl濃度勾配を用いて溶出させた。変異SOD-1蛋白からの銅遊離が細胞毒性の原因となるのではないかという仮説を検討するために上記の精製過程において各分画のSOD活性と蛋白濃度に加え銅イオン濃度の測定、HPLC-ESI/MSによる解析も行った。その結果、安定型のみならず不安定型においてもSOD活性とは無関係な異常な銅イオンの溶出を認めた。さらに、安定型においてはSOD蛋白以外の蛋白溶出が正常人と比べて増加している分画を見い出した。この分画を15%SDS-PAGEで検討したところ約12kDのバンドが増加していた。PVDF膜にブロット後アミノ酸シークエンスを行った結果、S-S結合還元作用を持つthioredoxin(Trx)と同定された。以上の結果より、安定型と不安定型変異SOD-1患者の赤血球細胞質内において変異蛋白からの異常な銅の遊離が起こっていると推察されたが、この遊離銅が細胞毒性を示す経路は、Trxが増加している安定型と増加が認められない不安定型とでは異なっている可能性が示唆された。

Autosomal superiority 伝を indicates that in patients with familial amyotrophic lateral sclerosis (fALS), hemolysateよ <s:1> resists ヒトSuperoxide (SOD dismutase - 1-1) ポ リ ク ロ ー ナ を ル antibody with い て た immune sink を, liquids ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー / quality analyzer (HPLC/ESI/MS) analytical す で る こ と で, normal お よ び - different protein を SOD - 1 identify し た. そ の results, variations exist different SOD protein - 1 の を confirm で き る quiet type (such as G37R, H46R) と く all exist を confirm で き な か っ た uneasy to finalize the design (2 salt I149T, 126 l owe loss, etc.) に classification さ れ た. The に, fragile な mutant SOD-1 protein <s:1> characteristics を adjustment べるために, よ SOD-1 protein <s:1> refinement in patient red blood cells を test みた. CM - 52 セ ル ロ ー ス で ヘ モ グ ロ ビ ン を sorption さ せ た サ ン プ ル を DE - 52 セ ロ ル - ス に add し, concentration of NaCl hooks with を い て dissolution さ せ た. - different SOD protein - 1 か ら の copper free が cytotoxicity の reason と な る の で は な い か と い う 仮 said を beg す 検 る た め に written の refining process に お い て SOD activity of each painting の と protein concentration に え copper イ オ の ン concentration determination, HPLC/ESI/MS に よ る parsing line も っ た. Type そ の results, stable の み な ら ず uneasy stereotypes に お い て も SOD activity と は masato is abnormal な な copper イ オ ン の dissolution を recognize め た. さ ら に type, stable に お い て は SOD protein outside の protein dissolution と が normal than べ て raised plus し て い る points draw を see い the し た. <s:1> <s:1> subdivide を15%SDS-PAGEで検 seek <s:1> たと ろ ろ ろ approximately 12kD <s:1> バ ドが ドが ドが increase て て た た た た After the PVDF membrane に ブ ロ ッ ト ア ミ ノ acid シ ー ク エ ン ス を line っ た results, S - S combination also yuan を hold つ thioredoxin (Trx) with fixed さ と れ た. の above results よ り type, stable と uneasy to finalize the design - different patients の SOD - 1 in red blood cell cytoplasm に お い て - different protein か ら の abnormal な copper の free が up こ っ て い る と push examine さ れ た が, こ の free copper が cytotoxicity を shown す は 経 road, Trx が raised plus し て い る quiet type と raised plus が recognize め ら れ な い uneasy stereotypes と で は different な っ て い る can The ability が indicates された.

项目成果

Okuda Y, Sakoda S, Fujimura H, Yanagihara T.: "Aminoguanidine,a selective inhibitor of the inducible nitric oxide synthase,has different effects on experimental allergic encephalomyelitis in the induction and progressin phase." J.Neuroimmunol. (in press).

Okuda Y、Sakoda S、Fujimura H、Yanagihara T.：“氨基胍是诱导型一氧化氮合酶的选择性抑制剂，对实验性过敏性脑脊髓炎的诱导期和进展期具有不同的作用。”

Okuda Y, Sakoda S, Bernard CCA, Fujimura H, Saeki Y, et al.: "IL-6 deficient mice are resistant to experimental autoimmune encephalomyelitis provoked by myelin oligodendrocyte glycoprotein." Int.Immunol. (in press).

Okuda Y、Sakoda S、Bernard CCA、Fujimura H、Saeki Y 等人：“IL-6 缺陷小鼠对髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白引起的实验性自身免疫性脑脊髓炎有抵抗力。”

Ogawa Y, Kosaka H, Nakanishi T, Shimizu A, Ohi T, Shoji H, et al.: "Stability of mutant superoxide dismutase-1 associated with familial amyotrophic lateral sclerosis determines the manner of copper release and induction of thioredoxin in erythrocytes." Bi

Okawa Y、Kosaka H、Nakanishi T、Shimizu A、Ohi T、Shoji H 等人：“与家族性肌萎缩侧索硬化症相关的突变超氧化物歧化酶 1 的稳定性决定了红细胞中铜释放和硫氧还蛋白诱导的方式。”

Kadekawa J, Fujimura H, Ogawa Y, Hattori N, Kaido M, et al.: "A clinicopathological study of a patient with familial amyotrophic lateral sclerosis associated with a two base pair deletion in the SOD1 gene." Acta Neuropathol.94. 617-622 (1997)

Kadekawa J、Fujimura H、Okawa Y、Hattori N、Kaido M 等人：“一项与 SOD1 基因中两个碱基对缺失相关的家族性肌萎缩侧索硬化症患者的临床病理学研究。”

Okuda Y, Sakoda S, Bernard CCA and Yanagihara T.: "The development of autoimmune encephalomyelitis provoked by myelin oligodendrocyte glycoprotein is associated with an up-regulation of both proinflammatory and immunoregulatory cytokines in the Central Ne

Okuda Y、Sakoda S、Bernard CCA 和 Yanagihara T.：“髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白引发的自身免疫性脑脊髓炎的发展与中枢神经系统中促炎细胞因子和免疫调节细胞因子的上调有关。