魚類用ユニバーサル発現ベクターの開発

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本研究では、イリドウイルスの幅広い宿主域を利用して、そのプロモーターを組み込んだ発現ベクターを作成することで、様々な魚種に利用可能な発現解析系を構築することを試みた。すなわち、既存プロモーターに見られる魚種特異性の問題が解決するものと思われ、得られたイリドウイルスプロモーターは、これまで医学や理学の分野で幅広く用いられ莫大な成果をもたらしてきたSV40あるいはCMVプロモーターと同等の役割を果たすと予想される。本年度は、(1)イリドウイルスプロモーターのクローン化、(2)蛍光タンパク質(Green Fluoresent Protein : GFP)とプロモーターを含むプラスミドの構築、(3)ゼブラフィッシュ受精卵へのインジェクション効率の検討、の3つの点に関して検討した。(1)イリドウイルス由来のATPase遺伝子の上流域994bp(あるいは439bp)およびMCP遺伝子の上流域1411bpをPCRで増幅し、両遺伝子のプロモーターの単離に成功した。また、マダイβ-アクチン遺伝子の下流域352bpについても同様の方法でクローニングした。(2)上記のイリドウイルス・プロモーター領域およびマダイβ-アクチンUTR領域を組み合わせて、GFPをレポーター遺伝子とする4種類のプラスミドを構築した。すなわち、(i)pEGFP/n:プロモーターのないもの、(ii)pEGFP/ATP044:ATPaseプロモーター(994bpの439bp領域)、(iii)pEGFP/ATP099:ATPaseプロモーター(994bp領域)、(iv)pEGFP/MCP141:MCPプロモーター(1411bp領域)。(3)ゼブラフィッシュ受精卵へのインジェクション効率を算出するために、インジェクションするDNA溶液の濃度およびGFP発現効率を指標とした。コントロールとして、アフリカツメガエルEF-1αプロモーターにGFPが連結した環状プラスミドを用いた。その結果、80ng/μl濃度で33%のGFP発現効率がみられた。