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環状ヌクレオチッドによる血管平滑筋細胞Ca輸送系の作用調節機構の研究

环核苷酸调控血管平滑肌细胞钙转运系统机制研究

基本信息

批准号：
01641544
负责人：
重川宗一
金额：
$ 1.15万
依托单位：
National Cardiovascular Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-01641544/
关键词：
血管平滑筋細胞膜Caポンプ Cキナ-ゼカルシウム膜電位

项目摘要

1)細胞膜Ca^<2+>pumpのプロテインキナ-ゼC(Cキナ-ゼ)による活性化の機構について、ウシ大動脈平滑筋から精製した細胞膜Ca^<2+>pump ATPase標品を用いて研究を行なった。細胞膜Ca^<2+>pump ATPaseのATP加水分解活性はCキナ-ゼ処理で活性化を受けたが、その活性化の様式はATPaseのCa^<2+>に対する親和性の上昇であった。次に、Ca^<2+>pump ATPaseをリン脂質膜小胞に埋め込んで、Ca^<2+>pumpを再構成し、リボソ-ム内へのATP依存性のCa^<2+>取込を測定した。やはりCa^<2+>に対する親和性の増大の形でCキナ-ゼによるCa^<2+>pumpの活性化が観察された。そこで、Ca^<2+>pump ATPaseの活性化がATPase自身のリン酸化によるものかどうかを、ATPaseに対する特異的モノクロ-ナル抗体を用いて調べた。平滑筋の細胞膜ATPase分画をCキナ-ゼ及び〔γ-32P〕ATP存在下でincubateし、抗Ca^<2+>ATPase抗体を結合させたアガロ-スビ-ズと反応させ、遠心後その沈澱をSDS-PAGEで解析した。免疫沈降させられた蛋白は分子量135KダルトンのCa^<2+>pump ATPaseのみで、オ-トラジオグラフィ-で調べるとその蛋白バンドのみがstoichiometry,1mol ATPase当り約1molでリン酸化されていた。さらにCa^<2+>pump ATPaseの燐酸化とATPaseの活性化との間によい相関があった。従って、血管平滑筋細胞の細胞膜Ca^<2+>pumpはCキナ-ゼの直接燐酸化によって活性の調節を受けることが強く示唆された。2)ラット大動脈平滑筋から調製した初代培養血管平滑筋細胞を用いて細胞膜Ca^<2+>pumpに対する膜電位の影響を調べた。細胞外液のカリウムイオノフォア存在下にカリウムイオン濃度を種々の濃度に変えることで膜電位を種々の値にクランプし、Ca^<2+>pump活性を外液Na非依存性の^<45>Ca^<2+>effluxとして測定した。Ca^<2+>pump活性は静止膜電位より過分極側で活性が抑制を受け、脱分極側で促進をうけた。このことはCa^<2+>pumpが起電位性を持つことを示唆する。さらに種々の膜電位を変化させる血管作動物質によって細胞膜のCa^<2+>pumpが活性の調節を受ける可能性をも示唆する。

1)Cell membrane Ca ^<2 +>pump ATPase standard was studied by using Ca^<2+>pump ATPase standard. The ATP hydrolysis activity of Ca^<2+>pump ATPase in cell membrane was affected by C ~(2 +) treatment, and the affinity of Ca^<2+> pump ATPase for ATP hydrolysis was increased. Ca ^2 +>pump ATPase was reorganized into lipid membrane vesicles and ATP dependent Ca^2 +> ATPase was determined. The increase in affinity for Ca^<2+> and Ca^<2+> was observed. The activation of Ca^<2+>pump ATPase is regulated by specific antibodies against ATPase itself. Cell membrane ATPase analysis of smooth muscle cells in the presence of γ-32P ATP incubate, anti-Ca ^<2+>ATPase antibody binding, reverse osmosis, telecentric precipitation SDS-PAGE analysis The molecular weight of Ca^<2+>pump ATPase is 135K. The molecular weight of Ca^<2+>pump ATPase is about 1mol. Ca^2+>pump ATPase phosphorylation and ATPase activation The cell membrane Ca^<2+>pump of vascular smooth muscle cells is regulated by the direct phosphorylation of C ^-2. 2) Regulation of vascular smooth muscle cells in primary culture by Ca^<2+>pump. Extracellular fluid concentration, concentration, membrane potential, concentration, Ca^2+>pump activity, Na independence, Ca^2 <45>+>efflux, in the presence of Ca^2+>, was measured. Ca^<2+>pump activity is inhibited by resting membrane potential, and promoted by depolarization. The Ca^<2+>pump has a high potential. The possibility of regulating the activity of Ca^+>pump in cell membrane by vasomotor substances