X線構造解析のためのDNA複製開始系蛋白質dnaAの結晶化

用于 X 射线结构分析的 DNA 复制起始系统蛋白 dnaA 的结晶

• 批准号: 02263203
• 负责人: 佐藤 能雅
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-02263203/
• 关键词: DNA複製開始; DnaA蛋白質; 結晶化; X線結晶構造解析

DNAの複製開始を制御する大腸菌dnaA蛋白質の機能構造をX線結晶構造解析によって解明することを目的とし,結晶化に向けた大量精製法の確立と,結晶化と活性にかかわる諸因子の探索を行った。精製標品量の確保を目指し,dnaA蛋白質は膜結合性であることから過剰生産株WM433菌体をリゾチ-ムとEDTAで処理したのちの硫酸アンモニウムによる沈澱画分得て,本蛋白質の精製を開始した。6段階からなる精製過程の各段階ではこのものの活性を評価する必要があるため,大腸菌TG1のoriC複製系の調製を併せて行った。活性を評価しながら大量精製を試みた結果,ここで用いた過剰生産株大腸菌ではdnaA蛋白質の発現量が極めて低下していることが判明し,その原因は不明である。多大な努力の結果にもかかわらずこれまでのところ,十分な量の精製標品を得ることには成功していない。得られた精製dnaA蛋白質は約1mgであり,活性に関与する諸因子を考慮しつつこれを用いて結晶化の条件を探索した。結晶化では,主に硫酸アンモニウムとMPD(2ーmethylー2,4ーpentanediol)を沈澱剤とし,ハンギングドロップ蒸気平衡法を採用した。精製標品量が少なくアモルファスの沈澱を生じ易いことから,蛋白質濃度を高くすることができず,また,常温では本蛋白質は会合して不安定なため,すべて6℃で蒸気平衡下で蛋白質を濃縮しながら,Mg^<2+>イオン,ADP,ATP,EDTA,sucrose等を適宜加えて結晶化を試みた。精製dnaA蛋白質を大量に得るための菌体と活性評価系,及び結晶化条件の検討を継続して行っている。

The functional structure of Escherichia coli dnaA protein was analyzed by X-ray crystallographic analysis, and the factors of crystallization and activity were explored. To ensure the amount of purified standard, the dnaA protein was separated from the production strain WM433 by precipitation after EDTA treatment, and the purification of the protein was started. 6. The regulation of TG1 and oriC replication system is necessary for the evaluation of the activity of each stage of the purification process. The activity of E. coli was evaluated. As a result, the production of dnaA protein in E. coli was extremely low, but the cause was unknown. How much effort has been made to achieve this goal? How much has been made to achieve this goal? To obtain purified dnaA protein about 1mg, activity related factors should be considered, and crystallization conditions should be explored Crystallization is carried out by the MPD(2-methyl-2,4-pentanol) precipitation method. The amount of purified standard is relatively small, the precipitation is easy to occur, the protein concentration is high, the protein concentration is unstable at room temperature, the protein concentration is concentrated at 6℃,Mg^<2+> 2,ADP,ATP,EDTA,sucrose, etc. are appropriately added, and crystallization is tried. A large amount of purified dnaA protein was obtained, and the cell activity was evaluated. The crystallization conditions were discussed.