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膜七回貫通型のヒト・アドレナリン受容体の結晶化とX線結晶構造解析

七种跨膜人肾上腺素受体的结晶及X射线晶体结构分析

基本信息

批准号：
14657579
负责人：
佐藤能雅
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞膜をαヘリックスが7回貫通する膜七回貫通型受容体は,アゴニストと特異的に結合して活性化し,細胞内にリガンド結合の情報を伝達する。本研究では,この受容体で代表的なヒトβ2アドレナリン受容体の構造をX線結晶解析により明らかにし,その機能の薬理学的な理解を得るために,結晶化に向けた,受容体を高純度で大量に調製する方法の構築を目的とした。メタノール資化性酵母Pichia pastorisの発現ベクターのpPIC9K(酵母のα-ファクターの分泌シグナルを利用)をこれまで調製したが,さらに,pPIC9とpPICZαのベクターに本受容体の遺伝子を組み込んだベクターを調製し,酵母のゲノム中に挿入した発現株を作製した。受容体のヒト遺伝子には,酵母では使用されないあるいは使用頻度が低いコドン(レアコドン)が含まれることから,酵母で使用されるコドンに置き換えたコドン最適化のコンストラクトを調製し,組換え株を得た。この最適化と培養法の改良により,糖タンパク質である本受容体の発現量を向上させた。ベクターをゲノム中にできるだけ多く組み込まれたpPIC9Kマルチプルコピー株を調製し,ホストとしてSMD1168株を用いたところ,従来の蛋白質発現株に比して,さらに数倍高い発現レベルが得られた。しかし,ファーメンター装置による高密度での細胞培養では,発現が著しく減少した。一方,pPIC9株あるいはpPICZα株の培養では,高密度でも発現は良好であった。精製では,PEGを用いて受容体を沈澱させて回収,種々の界面活性剤による可溶化,アフィニティーカラム,ゲル濾過カラムなどを用いる精製条件を種々検討した。また,受容体のリガンド結合活性を検定する方法を改良し,精製試料を短時間で大量に調製し,結晶化する見通しを得た。

The membrane was activated by the combination of the seven-loop receptor, the activation of the membrane, the activation of the receptor, and the activation of the membrane. The purpose of this study is to analyze the X-ray structure of the capacitor, which is represented by the capacitor. The X-ray structure of the capacitor is analyzed. The understanding of the physiology of the capacitor is clear, and the structure is crystallized. A large number of methods are used to determine the purpose of the capacitor. The recombinant yeast Pichia pastoris (yeast α-lactamase) showed that it was secreted by yeast alpha. The recombinant plasmid pPIC9K (yeast α-yeast secreted by yeast α-yeast) was used to detect the growth of the recipient. The capacitive body is sensitive, the yeast uses the capacity, the yeast uses the low temperature, the yeast uses the low temperature, the yeast uses the capacitor, the yeast uses the capacitor, the yeast, the yeast and the yeast. The best way to improve the quality of the body is to increase the volume of the capacitor. In the middle of the experiment, we need to know that there are several times higher levels of protein than that of the SMD1168 plant, which is much higher than that of the control group. In this case, we need to know that the protein is much higher than that of the SMD1168 plant. In order to improve the quality of the equipment, the high-density cell culture system has been developed. On the other hand, pPIC9 strain was cultured with pPICZ α strain, and high density strain was found to be good. For precision testing, PEG was used as a capacitor for thermal recovery, and all kinds of interfacial activities were dissolved. After testing, all kinds of chemical conditions were used. The method of capacitive assay combined with active assay has been improved, and the refined product has been used for a large number of tests in a short time.