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高親和性糖輸送担体の発現抑制による細胞増殖抑制作用に関する研究

抑制高亲和力糖转运载体表达抑制细胞增殖作用的研究

基本信息

批准号：
06282228
负责人：
清野裕
金额：
$ 2.62万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至 1995
项目状态：
已结题

项目摘要

我々はすでにヒトGLUT1遺伝子を単離し、転写開始部位および、5'-上流域の塩基配列を決定し報告した。さらに消化器癌や脳腫瘍でGLUT1の発現が著しく亢進し、癌細胞における細胞増殖に寄与する可能性を示した。本年度の研究において、この転写調節領域のDNA断片を制限酵素により処理し、数種類のdeletion mutantを作製してルシフェラーゼ発現プラスミドに組み込み、リン酸カルシウム法によりヒト肝癌細胞株HepG2に導入し、transient expressionの系でdeletionによる転写活性の変化を検討した。-317〜+181のDNA断片に対する5'-側からのdelectionでは、上流約200塩基を欠失させた-102〜+181のDNA断片までがきわめて強い転写活性を示し、さらに60塩基を欠失させた-40〜+181のDNA断片では活性が1/10まで低下し、このDNA断片から3'-側を欠失させた-40〜+55のDNA断片ではさらに活性が1/4となった。以上の知見より、ヒトGLUT1遺伝子の転写調節には転写開始点の上流-102塩基から下流+181塩基が特に重要であることが明らかとなった。引続き、培養したHepG2細胞より核抽出物を精製し、上記の-317〜+181のDNA断片を制限酵素処理して得た-312〜-168、-226〜-55、-102〜+74、-13〜+181の4種類のDNA断片を^<32>Pによって末端標識したプローブを用いてゲルシフト・アッセイを施工した。使用した4種類のプローブのいずれにも核蛋白が用量依存的に結合した。核蛋白の結合部位を特定するために行ったDNase Iフット・プリントでは、数カ所に核蛋白の結合によると考えられるラダーの変化が認められ、CCAAT配列、TATAA配列の他に、4カ所のTPA response element(TRE:TGACTACA)類似の配列を中心とする部分がDNase Iによる影響を受けにくくなっていた。先のdelection analysisの結果と合わせると、4か所のTRE類似配列のうち、-65付近と+60付近の配列がヒトGLUT1遺伝子の発現に深く関与していると予想されるため、今後、site directed mutagenesisなどの方法で変異を導入して転写活性の変化を検討する予定である。

We report on the location of the GLUT1, the location of the GLUT1, and the location of the GLUT 5. In addition, the increased expression of GLUT1 in digestive cancers and tumors shows the possibility of cell proliferation in cancer cells. This year's study focused on the regulation of DNA fragments in the regulatory domain by enzyme treatment, the production of several deletion mutants, the development of a novel DNA fragment, and the transformation of transcription activity in HepG2 cells by transfection, transient expression, and deletion. 317 ~+181 DNA fragment detection for the 5'-side of the DNA fragment, up to about 200 DNA fragment detection,-102 ~+181 DNA fragment detection, up to about 60 DNA fragment detection,-40 ~+181 DNA fragment detection, up to about 1/10 DNA fragment detection, up to about 3'-side of the DNA fragment detection,-40 ~+55 DNA fragment detection, up to about 1/4 DNA fragment detection. The above knowledge is very important, and the GLUT1 is very important. HepG2 cells were cultured for purification of nuclear extracts and restriction enzyme treatment of DNA fragments from-317 to +181 to-312 to-168,-226 to-55,-102 to +74, and-13 to +181 to 4 types of DNA fragments<32>. The use of four kinds of nuclear proteins is dose-dependent. The binding site of nuclear protein is determined by DNase I. The binding site of nuclear protein is determined by DNase I. The results of the prior selection analysis were combined with the results of the TRE similarity analysis,-65 and +60, respectively, and the results of the site directed mutation analysis were compared with the results of the site directed mutation analysis.