シグナル伝達におけるPHドメインと蛋白質リン酸化酵素活性制御領域の相互作用の解析

PHドメインは細胞内シグナル伝達に関与する多種類の蛋白質中に存在しその役割が注目を集めている。構造モデルから、PHドメインの結合物質の候補として本研究申請時にはセリン/トレオニンリン酸等の陰イオン化小分子が想定されていたが、その後の研究によりホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸等の脂質誘導体やG蛋白質βγサブユニット、プロテインキナーゼC(PKC)等の複数の物質と結合することが報告され、その結合の意義の解析が行なわれている。本研究ではその構造中にPHドメインを有するセリン/トレオニン蛋白質リン酸化酵素、RACプロテインキナーゼを用いてPHドメインとPKCの相互作用の解析を実施した。まず、RACプロテインキナーゼについてサブタイプの検索を行ない、従来、存在の知られていた2種類以外に3番目の新規クローンを分離し、これら3種類のRACプロテインキナーゼを培養細胞に発現し単一蛋白質として精製し、これらのRACプロテインキナーゼがセリン/トレオニン蛋白質リン酸化酵素活性をもつことを確認した。ついで、3種類のRACプロテインキナーゼのそれぞれのPHドメインとGSTとの融合蛋白質を作製し、試験管内でPKC分子種および蛋白質βγサブユニットとの結合を検討した。その結果、cPKC、nPKC、aPKCグループの代表的なPKC分子種ならびにG蛋白質βγサブユニットがいずれもPHドメインと結合することが示された。また、RACプロテインキナーゼとPKCとの共発現細胞を用いて免疫沈降法により両者の結合を解析したところ、RACプロテインキナーゼとPKCとの結合には組み合わせがあることが明らかになった。そこで、今後はこれらの成果に基づきPHドメインとPKCの相互作用の分子機構の解析を実施する。

PHドメインは細胞内シグナル伝達に関与する多種類の蛋白質中に存在しその役割が注目を集めている。構造モデルから、PHドメインの結合物質の候補として本研究申請時にはセリン/トレオニンリン酸等の陰イオン化小分子が想定されていたが、その後の研究によりホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸等の脂質誘導体やG蛋白質βγサブユニット、プロテインキナーゼC(PKC)等の複数の物質と結合することが報告され、その結合の意義の解析が行なわれている。本研究ではその構造中にPHドメインを有するセリン/トレオニン蛋白質リン酸化酵素、RACプロテインキナーゼを用いてPHドメインとPKCの相互作用の解析を実施した。まず、RACプロテインキナーゼについてサブタイプの検索を行ない、従来、存在の知られていた2種類以外に3番目の新規クローンを分離し、これら3種類のRACプロテインキナーゼを培養細胞に発現し単一蛋白質として精製し、これらのRACプロテインキナーゼがセリン/トレオニン蛋白質リン酸化酵素活性をもつことを確認した。ついで、3種類のRACプロテインキナーゼのそれぞれのPHドメインとGSTとの融合蛋白質を作製し、試験管内でPKC分子種および蛋白質βγサブユニットとの結合を検討した。その結果、cPKC、nPKC、aPKCグループの代表的なPKC分子種ならびにG蛋白質βγサブユニットがいずれもPHドメインと結合することが示された。また、RACプロテインキナーゼとPKCとの共発現細胞を用いて免疫沈降法により両者の結合を解析したところ、RACプロテインキナーゼとPKCとの結合には組み合わせがあることが明らかになった。そこで、今後はこれらの成果に基づきPHドメインとPKCの相互作用の分子機構の解析を実施する。