フリーラジカル損傷DNAの修復に関与する酵素の研究

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フリーラジカルによるDNA損傷の中で、生細胞内で直接または間接に毎日多数生じている塩基欠落部位(APサイト)および3′ブロック一本鎖切断の修復に関与する酵素を研究した。本研究のためのDNA修復系には、ferric nitrilotriacetate(Fe^<3+>-NTA)と過酸化水素で損傷したプラスミドDNA、または酸処理で部分的に脱プリン化したプラスミドをDNA基質とした。そして、これら損傷の修復開始に関与する酵素は、私達がAPEXヌクレアーゼと呼んでいる多機能APエンドヌクレアーゼが主体であることを活性ブロッティング法で示した。別に30kDaのAPエンドヌクレアーゼ/DNA3′-修復ジエステラーゼを分離・精製し、部分アミノ酸配列を決めた。現在本酵素のcDNAクローニングを試みているがまだ成功していない。APEXヌクレアーゼでAPサイトの5′側に切れ目を入れたときに残る5′ブロック(5′デオキシリボースリン酸)を除くdRpase様酵素についても検索しているが、その一つ45kDaタンパク質は精製して部分アミノ酸配列を決めた結果、すでに報告されているDNaseIV(FEN-1)であることが判明した。本酵素の修復への関与をさらに明らかにするために、既に報告されているcDNAの配列に基づいてマウスcDNAをクローニングしており、本酵素を大量発現してその役割を検討する予定である。Fe^<3+>-NTAと過酸化水素で損傷したDNAに、APEXヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、4dNTPs、45kDaタンパク質、DNAリガーゼおよびATPを加えて、精製酵素によるDNA修復系を構築した。現在、この系でラジカル損傷DNAの修復に関与する因子の解析を続行している。