X線損傷DNAの修復開始に関与していると推定されるヒト細胞修復酵素の研究

研究推测参与 X 射线损伤 DNA 修复启动的人体细胞修复酶

• 批准号: 03152088
• 负责人: 関 周司
• 金额: $ 3.26万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Cancer Research
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03152088/
• 关键词: DNA修復酵素; X線損傷DNA; APエンドヌクレア-ゼ; エキソヌクレア-ゼ; cDNAクロ-ニング; 除去修復酵素; ヒト細胞

1.X線損傷等によって生じたDNAの一本鎖切断やapurinic/apyrimidinic(AP)sitesの修復開始に関与していると推定される修復酵素を、マウス腹水肉腫瘍細胞及びヒト培養細胞(HeLa細胞)から分離精製し、本酵素がAP endonuclease,3'ー5'exonuclese,DAS 3'repair diesterase,DNA3'ーphosphatase活性を示す分子量35、000の多機能DNA修復酵素(APEX nucleaseと命名)であることを明らかにした。2.マウス及びヒトの本酵素cDNAをcloningし、それらの塩基配列を決定し、タンパクの一次構造を推定した。その一次構造が当該酵素のものであることは、精製酵素から決定した部分アミノ酸配列と比較し確かめた。3.本酵素mRANは1.5kb一種類検出された。4.本cDNAのタンパクコ-ド領域をpUC18のlacZ promoterの下流に挿入して発現プラスミドを構築した。本プラスミドを大腸菌のBW2001株(ExoIII^-、EndoIV^-)及びBW9109株(ExoIII^-)細胞に導入し、形質転換細胞を得、本酵素活性を示すハイブリッドタンパクの発現を認めこれを精製した。またこの形質転換細胞は、AP sitesや3'プロック端DNA損傷を生じる薬剤methyl methaneーsulfonateやtertーbutyl hydroperoxide抵抗性で、発現タンパクがこれらDNA損傷修復に関与していることを示唆した。5.本APEX nucleaseは、酵素学的性状、生理機能、タンパクの一次構造等が大腸菌の主要なAP endonucleaseであるexonuclease IIIと類似しており、またStreptococcus pneumoniaeのexoAタンパクやDrosophilaのRrp1タンパクとも類似しており、これらと同族酵素と考えられた。6.今後は、(1)本酵素遺伝子(APX遺伝子)をcloningし、その構造解析、(2)染色体上の遺伝子座究明、(3)特異抗体作成、(4)生理機能の究明、(5)発がんや抗癌剤耐性獲得において本修復酵素の発現異常が関与する場合があるかどうかの検討等を行う予定で計画を進めている。

1. X-ray damage, etc. A lock-in cleavage of DNA, apurinic/apyrimidinic(AP)sites, and the initiation of repair are presumed to be related to the isolation and purification of repair enzymes, including AP endonuclease,3'-5' exonuclease,DAS 3'repair diesterase,DNA3'-phosphatase activity. Molecular weight 35. 000 multifunctional DNA repair enzyme (APEX nuclease) 2. cDNA cloning and sequencing of the enzyme The primary structure of the enzyme is determined by the acid alignment. 3. The mRAN of this enzyme was detected in 1.5kb. 4. Construction of the cDNA fragment downstream from the lacZ promoter of pUC18 This enzyme was introduced into E. coli BW2001 (ExoIII^-, EndoIV^-) and BW9109 (ExoIII^-) cells, transformed cells were obtained, and enzyme activity was demonstrated. These morphologically altered cells are resistant to methyl methane sulfonate and tert-butyl peroxide in the presence of AP sites and 3'-terminal DNA damage, which is associated with DNA damage repair. 5. This APEX nucleotide is similar to the main AP endonuclease III of Escherichia coli, such as enzymatic properties, physiological functions, primary structure, etc., and the exoA of Streptococcus pneumoniae is similar to Drosophila. 6. In the future,(1) cloning and structural analysis of this enzyme gene (APX gene),(2) study of gene loci on chromosomes,(3) preparation of specific antibodies,(4) study of physiological functions,(5) development of anticancer agent resistance, acquisition of abnormal expression of this repair enzyme, etc. will be carried out.

项目成果

Zhang,Bo: "DNA damage by peplomycin and its repair in an vitro system." Int.J.Biochem.23(7/8). 703-711 (1991)

张波：“佩普霉素对 DNA 的损伤及其在体外系统中的修复。”

Seki,Shuji: "A mouse DNA repair enzyme (APEX nuclease) having exonuclease and apurinic/apyrimidinic endonuclease activities:purification and characterization." Biochim.Biophys.Acta. 1079(1). 57-64 (1991)

Seki,Shuji：“具有核酸外切酶和无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶活性的小鼠 DNA 修复酶（APEX 核酸酶）：纯化和表征。”

関 周司: "ヒト細胞多機能DNA修復酵素APEXヌクレア-ゼのcDNAクロ-ニングと大腸菌での発現." 第14回日本分子生物学会年会. 205 (1991)

Shuji Seki：“人类细胞多功能 DNA 修复酶 APEX 核酸酶的 cDNA 克隆和表达。”第 14 届日本分子生物学会年会（1991 年）。

Seki,Shuji: "DNA cloning,sequencing,expression and possible domain structure of human APEX nuclease homologous to Escherichia coid exonuclease III."

Seki、Shuji：“与大肠杆菌核酸外切酶 III 同源的人 APEX 核酸酶的 DNA 克隆、测序、表达和可能的结构域结构。”

関 周司: "哺乳類細胞のDNA修復酵素及び核マトリックスDNA結合タンパク質の研究" 岡山医学会雑誌. 103(3). 349-359 (1991)

Shuji Seki：“哺乳动物细胞中 DNA 修复酶和核基质 DNA 结合蛋白的研究”冈山医学会杂志 103(3) 349-359 (1991)。