X線損傷DNAの修復開始に関与していると推定されるヒト細胞修復酵素の研究

研究推测参与 X 射线损伤 DNA 修复启动的人体细胞修复酶

基本信息

批准号：
04152081
负责人：
関周司
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

X線等放射線や活性酸素によって生じるDNAの一本鎖切断および多くの要因で生じるDNA塩基欠失部位(AP sites)の修復開始に関与すると推定される多機能DNA修復酵素(APEX nucleaseと命名;分子量35.4kDa)の性状を検討した。1.前年度クローニングしたヒト本酵素cDNAのタンパク質コード領域を挿入した発現プラスミドを構築し、これでexonuclease III(APEX nucleaseはこのexo IIIのホモローグ)欠損大腸菌株細胞を形質転換した。形成転換細胞は、親株細胞に比し、AP sitesを生じる薬剤および一本鎖切断を生じる薬剤に抵抗性を示し、本酵素が予想通りの生理活性を持つことを示した。2.本酵素一次構造のホモロジー比較から、核局在シグナルをもつ6kDaのN末領域とexo III等とホモロジーを示す29kDaのC末領域(活性ドメイン)から成ることが示唆された。本酵素精製の過程で、35kDa、33kDaおよび31kDaの活性な酵素断片が生じた。前2つの断片はsubtilisin様のプロテアーゼで、31kDaの断片は化学的機構でN末アミノ酸の一部が除かれて生じることが判明した。これらの結果は推定ドメイン構造を支持した。3.測定した全ての細胞に本酵素は存在しており、house keeping enzymeと考えられた。X線照射や薬剤処理でHeLa細胞に本酵素の誘導を試みたが、誘導されなかった。4.ヒトの白血球ゲノムライブラリーから本酵素遺伝子をクローニングし、塩基配列をきめた。本遺伝子は、2.64kbで5つのエキソンから構成されていた。5.今後、発がんと本酵素との関係を研究するためにはアンチセンスRNAの発現により本酵素量を低下させたり、本酵素遺伝子を破壊してみる必要があると考えられた。また、本酵素が関与するDNA修復系を一体として研究するため、本酵素の次のステップに関与する酵素dRpaseも研究する必要があるとの結論を得た。現在これらの研究を開始している。

假定的多功能DNA修复酶（称为Apex核酸酶；分子量为35.4 kDa）的性能与DNA碱基缺失位点的修复（Apex核酸酶）的启动有关，由X射线添加和活性氧气引起的X射线基础氧和活性基础损坏位点的修复（许多因素）（许多因素）（许多dna base deletion debe）（许多因子）。 1。构建了一个表达质粒，其中插入了前一年的人酶cDNA的蛋白质编码区域，并将其转化为缺乏外核酸酶III的大肠杆菌菌株细胞（Apex核酸酶是Exo III的同源物）。与亲本细胞相比，转化细胞对产生AP位点和产生单链断裂的药物的药物具有抵抗力，表明该酶已经预测了生理活性。 2。该酶的主要结构的同源性比较表明，它由带有核定位信号的6KDA N末端区域组成，在纯化此酶的纯化过程中显示了与Exo III等的同源性的29KDA C末端区域（活性域），该酶的活性酶片段的35KDA，333KDA和31KDA。前两个片段是枯作蛋白样的蛋白酶，当去除某些N末端氨基酸时，发现31 kDa片段是通过化学机制产生的。这些结果支持推定的域结构。 3。该酶存在于所有测量的细胞中，被认为是保存酶的房屋。我们试图通过X射线照射或药物处理来诱导HeLa细胞中的酶，但并未诱导。 4。从人白细胞基因组文库中克隆酶基因，并确定碱基序列。该基因为2.64KB，由五个外显子组成。 5。将来，人们认为，为了研究癌变与这种酶之间的关系，有必要通过表达反义RNA或破坏该酶基因来减少该酶的量。还可以得出结论，为了研究涉及该酶的DNA修复系统，有必要研究该酶的下一步酶DRPase。这些研究目前正在开始。