NMDA受容体刺激で誘導されるシナプスに局在する高分子の検索

中枢神経系シナプスにおける神経伝達は、興奮性アミノ酸のグルタミン酸に主に依存しているが、中でもNMDA型グルタミン酸受容体を介するものは、長期増強(LTP)に代表される伝達効率の変化、並びに発達期のシナプスの再構成や安定化に重要な役割を果たしていると考えられている。本研究では、視覚野皮質神経細胞においてNMDA受容体の特異的な刺激で誘導されるシナプス蛋白、もしくはその遺伝子(mRNA)を複数同定しその機能を知ることにより、NMDA受容体がどの様にシナプスの再構成や安定化に寄与しているか探る計画である。本年度においては、ラット胎児の大脳皮質より調整した初代神経細胞を用い、マグネシウムイオン非存在下、テトロドトキシンなどで二次的神経伝達を阻害した条件のもとで、これら細胞にNMDAをパルス投与(3分程度)し、NMDA受容体特異的刺激を実現した。またそれとは逆に、NMDA受容体のアンタゴニストであるAP5を継続的に培養液に添加することで、NMDA受容体阻害群も調整した。これらの3群、NMDA受容体刺激カルチャー、NMDA受容体阻害カルチャー、コントロールカルチャーより総RNAを注出し、逆転写酵素でcDNAに変換した後、差分提示PCR法によりcDNAのパネリングを行った。その結果、NMDA受容体刺激でのみ誘導されるcDNA種、48個、逆にNMDA受容体阻害で誘導されるcDNA種、6個を同定した。DNAシークエンスの結果、それらのうち6種類はジーンバンクに登録されている既存のものであった。その他のクローンに関して、ノザンブロットによりそのRNA分布を調べたところ8クローンが脳において強い発現を呈した。これらのクローンはいずれも3ダッシュ非翻訳領域に対応している可能性が高く、そのタンパク機能を推測できないので、現在、より上流のクローニングを試みている。

中枢神経系シナプスにおける神経伝達は、興奮性アミノ酸のグルタミン酸に主に依存しているが、中でもNMDA型グルタミン酸受容体を介するものは、長期増強(LTP)に代表される伝達効率の変化、並びに発達期のシナプスの再構成や安定化に重要な役割を果たしていると考えられている。本研究では、視覚野皮質神経細胞においてNMDA受容体の特異的な刺激で誘導されるシナプス蛋白、もしくはその遺伝子(mRNA)を複数同定しその機能を知ることにより、NMDA受容体がどの様にシナプスの再構成や安定化に寄与しているか探る計画である。本年度においては、ラット胎児の大脳皮質より調整した初代神経細胞を用い、マグネシウムイオン非存在下、テトロドトキシンなどで二次的神経伝達を阻害した条件のもとで、これら細胞にNMDAをパルス投与(3分程度)し、NMDA受容体特異的刺激を実現した。またそれとは逆に、NMDA受容体のアンタゴニストであるAP5を継続的に培養液に添加することで、NMDA受容体阻害群も調整した。これらの3群、NMDA受容体刺激カルチャー、NMDA受容体阻害カルチャー、コントロールカルチャーより総RNAを注出し、逆転写酵素でcDNAに変換した後、差分提示PCR法によりcDNAのパネリングを行った。その結果、NMDA受容体刺激でのみ誘導されるcDNA種、48個、逆にNMDA受容体阻害で誘導されるcDNA種、6個を同定した。DNAシークエンスの結果、それらのうち6種類はジーンバンクに登録されている既存のものであった。その他のクローンに関して、ノザンブロットによりそのRNA分布を調べたところ8クローンが脳において強い発現を呈した。これらのクローンはいずれも3ダッシュ非翻訳領域に対応している可能性が高く、そのタンパク機能を推測できないので、現在、より上流のクローニングを試みている。