ヒト由来DNA修復酵素の超高感度スクリーニングと精製

人源DNA修复酶的超灵敏筛选和纯化

基本信息

批准号：
08264218
负责人：
井出博
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08264218/
关键词：
DNA修復酵素 DNA損傷活性酵素突然変異オリゴヌクレオチド

项目摘要

活性酸素や電離放射線などフリーラジカルに由来するDNA損傷は、生成する損傷が多用なため、遺伝的な影響や修復酵素の解明が遅れている。DNA損傷の遺伝的な影響や修復酵素の研究を行う場合、特定の損傷を含むオリゴヌクレオチドを基質として用いることにより、従来限定された範囲でしか行えなかったDNA複製エラーや修復酵素のスクリーニングが効率よく行えると考えられる。本研究では、第一段階と、多数存在する活性酸素由来のDNA損傷の中から、突然変異性が高く発がんに深く関わると予想される損傷のオリゴヌクレオチド基質への導入と突然変異性の確認を目的として以下の実験を行った。1.分子構造的な観点からDNA複製エラーを誘発しやすいと予想されるα-deoxyadenosine(α)及び5-formyluracil(fU)をオリゴヌクレオチドに選択的に導入する方法を検討した。αはホスホロアミダイト法によりオリゴヌクレオチドへの導入が可能であった。fUは同様な方法では分解が起こることが分かり、より穏和な方法を検討した。この目的で、DNAポリメラーゼ基質として,fUのヌクレオチド三リン酸(fdUTP)を合成し、酵素反応によりオリゴヌクレオチドに導入した。2.αを導入したオリゴヌクレオチドをM13ベクターに組み込み、大腸菌にトランスフェクションした後、得られたprogeny phageのシーケンス解析を行った。その結果、αは選択的に一塩基欠失を誘発し、その頻度は塩基配列に依存することが明らかとなった。fUの突然変異性は、in vitroでDNAポリメラーゼによるfdUTPの取込挙動に基づき評価した。その結果、fUはアデニンと正しい塩基対を形成するほか、グアニンとミスマッチを形成しやすくなることが示された。さらに詳細な検討から、グアニンとのミスマッチにはイオン化型のfUが関与することが明らかとなった。今後、変異性の高い損傷を導入したオリゴヌクレオチドを基質として、高等動物由来のDNA修復酵素の検索・精製を行うことを計画している。

从自由基（例如活性氧和电离辐射）产生的DNA损伤通常用于产生损伤，从而减慢了遗传效应和修复酶的阐明。在研究DNA损伤和修复酶的遗传作用时，可以认为，通过使用包含特定损伤作为底物的寡核苷酸，可以有效筛选DNA复制误差和仅在有限范围内进行的修复酶。在这项研究中，进行了以下实验，以引入第一阶段的损伤，以及来自活性氧的众多DNA损伤，这些氧气高度可变，预计将与癌变深度参与寡核苷酸底物，并确认突变。 1。我们研究了一种选择性地引入α-脱氧粉刺（α）和5-甲基尿素（FU）的方法，这些方法有望从分子结构的角度诱导DNA复制误差，从分子结构的角度诱导寡核苷酸。 α可以通过磷酰胺法引入寡核苷酸。发现FU的分解以类似的方法发生，并研究了一种更温和的方法。为此，将FU的三磷酸核苷酸（FDUTP）合成为DNA聚合酶底物，并通过酶促反应引入寡核苷酸。 2。将带有α引入的寡核苷酸掺入M13载体中，转染到大肠杆菌中，对所得的后代噬菌体进行了顺序分析。结果，发现α有选择地诱导单个碱基缺失，其频率取决于基本序列。根据DNA聚合酶FDUTP的摄取行为，在体外评估了FU的突变性。结果表明，FU与腺嘌呤形成正确的碱基对，并且更有可能与鸟嘌呤形成不匹配。进一步的详细检查表明，电离FU参与与鸟嘌呤的不匹配。将来，我们计划使用高度可突变的寡核苷酸作为底物来搜索和净化高等动物的DNA修复酶。