酸化的DNA障害を認識する高等真核生物由来の修復酵素

来自高等真核生物的修复酶可识别氧化 DNA 损伤

基本信息

批准号：
09253238
负责人：
井出博
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09253238/
关键词：
DNA損傷 DNA修復酵素酸化チミングリコールエンドヌクレアーゼ

项目摘要

本研究では、オリゴヌクレオチドに対する酸化損傷の導入法の開発を行うとともに、これを基質として高等動物由来DNA修復酵素の酵素特性の解析を行った。1 酵素基質合成thymine glycol(TG)は、チミンを1ケ所だけ含むオリゴヌクレオチドを過マンガン酸カリウムで酸化することにより導入した。目的とする生成物(19TG)は、逆相HPLC及びゲル濾過により精製した。次に、19TGのアルカリ処理により、ureaを含むオリゴヌクレオチド(19UREA)を調製した。2 酵素特性の解析methylpurine DNA glycosylase(hMPG)は、ヒト細胞における主要なアルキル化塩基修復酵素であり、基質特異性も大腸菌のAlkAと多くの部分でオーバーラップしている。hMPGを大腸菌で発現しタンパク質を精製後、アルキル化及び酸化損傷塩基を含むオリゴヌクレオチド基質を用いて基質特異性を検討した。hMPGは、7-methylguanine,ethenoadenine,hypoxanthineを認識したが、同様な条件下で酸化損傷5-formyluracil及び8-oxoguanineは認識しなかった。最近クローニングされたマウスのendonucleaseIIIホモログ(mNth1)の酵素特性の解析を行った。[^3H]TGを導入したM13DNAとmNth1をインキュベートすると、放射活性がDNAからリリースされ、HPLC分析により遊離のTGであることを確認した。19TG及び19UREAを基質としてmNth1を作用させると、TGおよびureaの3'側でβ脱離した生成物が確認された。以上の結果は、mNth1がendonucleaseIIIと同様に酸化的なピリミジン塩基損傷の修復に関わる酵素であり、同一タンパク質内にN-グリコシラーゼとAPリアーゼ活性をもつことを示している。

在这项研究中，我们开发了一种对寡核苷酸引入氧化损伤的方法，并将其用作底物来分析源自上等动物的DNA修复酶的酶特性。 1酶底物合成胸腺嘧啶甘氨酸（TG）是通过氧化仅含有一种硫氨酸含钾的寡核苷酸来引入的。通过反向相HPLC和凝胶过滤纯化所需的产品（19TG）。接下来，通过19tg的碱处理制备了含有尿素（19EREA）的寡核苷酸。 2酶特性的分析甲基嘌呤DNA糖基化酶（HMPG）是人类细胞中的主要烷基化碱修复酶，底物的特异性在埃斯切里希亚大肠杆菌中许多部分的底物特异性也重叠。在大肠杆菌中表达HMPG并纯化蛋白质后，使用含有烷基化且氧化损坏的碱的寡核苷酸底物研究了底物特异性。 HMPG在相似条件下识别7-甲基鸟嘌呤，乙氨酸氨基氨酸，甲黄嘌呤，但未氧化损伤5-甲基尿素和8-氧气。分析了最近克隆的小鼠核酸内切酶III同源物（MNTH1）的酶特性。 [^3H] TG引入的M13 DNA和MNTH1孵育，并从DNA中释放放射性，并通过HPLC分析确认为游离TG。当使用19tg和19Urea作为底物应用MNTH1时，确认在TG和尿素的3'侧具有β-脱纤维的产物。以上结果表明，像核酸内切酶III一样，MNTH1是一种参与修复氧化嘧啶碱基损伤的酶，并且在同一蛋白质中具有N-糖基酶和AP裂解酶活性。