NOにより形成されるDNA-タンパク質クロスリンクの遺伝的影響と修復

NO 形成的 DNA-蛋白质交联的遗传效应和修复

基本信息

批准号：
13214071
负责人：
井出博
金额：
$ 2.82万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

異物進入に対するマクロファージの活性化により生体内で発生するNO及びこれに由来する窒素酸化物の遺伝子レベルでの直接的な毒性や発がんへの関与については未知の部分が多い。これまでの研究から,生物学的に意味のある低濃度のNOの暴露では,DNA損傷としてオキザニンが生成することが示された。オキザニンの構造を考慮すると,核内に存在する低分子アミンやDNA結合タンパク質と損傷がクロスリンクし,二次的に形成されたDNA損傷が細胞致死や突然変異を誘発する可能性がある。そこで,オキザニンを特異的に含むDNA基質を用いて生体ポリアミンとの反応を検討した結果,実際にクロスリンク生成物が生じることが明らかとなった。さらに,オキザニンを含むDNAと核内に存在するDNA結合タンパク質の間でクロスリンクが形成されるか検討した。その結果,オキザニンは,ヒストン,HMGタンパク質,プリン塩基損傷修復酵素(hOGG1等)とクロスリンクを形成すること,さらに,クロスリンク形成速度は,ヒストン・HMGタンパク質に比べDNA修復酵素の方が圧倒的に速いことが明らかとなった。DNA修復酵素で反応が起こったことは,オキザニンがDNA-タンパク質クロスリンクの前駆体としてだけでなく,修復酵素の自殺基質としても重要であることを示している。HeLa細胞の核抽出物を用いた実験でも,抽出物中にオキザニンとクロスリンクする複数のタンパク質が存在することが示された。クロスリンク反応に関与するタンパク質中のアミノ酸を推定するために,個々のアミノ酸の反応性を検討した結果,アルギニン及びリジン側鎖が反応に関与することが示された。クロスリンク修復に対するヌクレオチド除去修復機構の関与を調べるために,DNA-タンパク質クロスリンクを含む長鎖DNA基質を調製した。

关于巨噬细胞激活了巨噬细胞对异物的进入，以及它们在基因水平上参与致癌作用，因此有许多未知的关于直接毒性和无产生的体内和氮氧化物的参与。先前的研究表明，在生物学上有意义的生物学上暴露于低浓度的NO导致黄油作为DNA损伤的产生。考虑到黄油的结构，损伤可以与核中存在的小分子胺和DNA结合蛋白交联，次级DNA损伤可以诱导细胞致死性和突变。因此，当我们使用特异性含有黄油的DNA底物研究与生物多胺的反应时，发现实际上会发生交联产物。此外，还研究了是否在核中存在的含氧DNA和DNA结合蛋白之间形成了交联。结果表明，黄油与组蛋白，HMG蛋白和嘌呤碱基损伤修复酶（HOGG1等）交联，并且与组蛋白和HMG蛋白相比，用DNA修复酶使用交联的形成速率要快得多。反应发生在DNA修复酶中，表明黄油不仅是DNA-蛋白交联的前体，而且作为修复酶的自杀底物。使用HeLa细胞的核提取物进行的实验还表明，在提取物中与黄油交联的多种蛋白质。为了估计参与交联反应的蛋白质中的氨基酸，我们研究了单个氨基酸的反应性，并表明精氨酸和赖氨酸侧链参与了反应。为了研究核苷酸切除修复机制以进行交联修复，制备了含有DNA-蛋白质交联的长链DNA底物。