分子プローブを用いた呼吸系プロトンチャンネルの動態解析

使用分子探针动态分析呼吸质子通道

• 批准号: 08268216
• 负责人: 茂木 立志
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08268216/
• 关键词: 分子プローブ; プロトン; チャネル; 呼吸鎖; 末端酸化酵素; 動態; ポンプ; 分光学的測定

大腸菌キノール酸化酵素を末端酸化酵素のモデル系として、呼吸系プロトンチャネルの研究を進め、以下の成果を得た。1)ナノ計測系の構築:プロトンの輸送経路の同定、輸送経路の微細構造とプロトン輸送の動態の解明を目的として、酵素分子表面に導入したアンカーに分子プローブ(pHプローブや光励起性電子供与基)を結合させ、電子移動に伴うプロトン輸送の反応素過程を高時間分解能で解析するためのナノ計測系を構築した。サブμ秒分解能の時間分解分光システムを完成させ、また、サブユニットI-IVのCys残基を全てSerに置換したCys-free酵素を材料としてチャネル出入り口の予想部位にユニークなCys残基の導入を行った。2)酵素複合体の構造:サブユニットIVの置換変異と復帰変異の解析、架橋実験から、本酵素の構造は土壌細菌のチトクロムc酸化酵素に類似していることを明らかにした。また、6Åの反射を示す結晶を得、現在、構造学的にチャネルを同定するために結晶化条件の検討を進めている。3)基質酸化部位の構造と機能:大腸菌酵素は、基質の酸化還元に伴って放出・消費されるプロトンのためのチャネルを備えている。キノール酸化部位(Q_L)の構造特性を明らかにするため、系統的に合成したユビキノン誘導体を用いて置換基の効果を検討した。Q_L部位は2-メトキシ基と5-メチル基の認識部位に立体的な制約を持ち、6-イソプレニル基は結合親和性の増加に関与することを見い出した。一方、高親和性キノン結合部位(Q_H)は、Q_Lとは異なる結合特性を持つことを示した。好気的増殖を抑制するキノンアナログの耐性変異株を取得し、その解析を行った。以上の研究から、サブユニットIIのQ_Lで2電子酸化が起こり、Q_HはサブユニットIの低スピンヘムに逐次的に1電子伝達を行うのみならず、リザーバーとして電子移動を調節することが示唆された。

Coliform キ ノ ー ル を end acidification acidification enzyme enzyme の モ デ ル department と し て, respiratory プ ロ ト ン チ ャ ネ ル を め, the following の の research を た. 1) ナ ノ measuring の construct: プ ロ ト ン の conveyor の 経 road, transport 経 way の fine-structure と プ ロ ト ン conveying の dynamic の interpret を purpose と し て, enzyme molecular surface に import し た ア ン カ ー に molecular プ ロ ー ブ (pH プ ロ ー ブ や excitation light up electronic base and supply) を combining さ せ and electronic mobile に う プ ロ ト ン conveying の を high anti 応 element process Time decomposition can で analyze するため ナノ ナノ measurement system を construction <s:1> た. サ ブ spectral decomposition can の mu seconds decomposition シ ス テ ム を complete さ せ, ま た, サ ブ ユ ニ ッ ト I - IV の Cys residue を full て Ser に replacement し た Cys - free enzyme を material と し て チ ャ ネ ル discrepancy り の mouth to want to place に ユ ニ ー ク な Cys residue の import line を っ た. 2) enzyme complex の structure: サ ブ ユ ニ ッ ト の replacement - different と after 帰 IV - different の parsing, bridging be 験 か ら, this enzyme の structure 壌 は soil bacteria の チ ト ク ロ ム c acidification enzyme に similar し て い る こ と を Ming ら か に し た. ま た, 6 a の reflection を す crystallization を too, now, the tectonics に チ ャ ネ ル を with fixed す る た め に crystallization conditions の beg を 検 into め て い る. 3) matrix acidizing の structure と function: の は coliform enzyme, matrix acidizing and yuan に with っ て release, consumption さ れ る プ ロ ト ン の た め の チ ャ ネ ル を prepared え て い る. キ ノ ー ル acidification parts (Q_L) の tectonic features を Ming ら か に す る た め, system に synthetic し た ユ ビ キ ノ ン inductor を with い て replacement base の unseen fruit を beg し 検 た. Q_L parts は 2 - メ ト キ シ base と 5 - メ チ ル base の know parts に stereo な restriction を hold ち, 6 - イ ソ プ レ ニ ル base は combined with affinity の raised に requirement by masato and す る こ と を see い out し た. One party, the high-affinity キノ <e:1> binding site (Q_H), Q_Lと heterotic なる binding characteristics を hold た た とを とを indicate た た. The growth of good conditions を inhibits するキノ アナログ アナログ <s:1> tolerant variant plants を obtain を, そ <s:1> analysis を lines った. Above の research か ら, サ ブ ユ ニ ッ ト II の Q_L で 2 electronic acidification が up こ り, Q_H は サ ブ ユ ニ ッ ト I の low ス ピ ン ヘ ム に successive に 1 electronic 伝 line of を う の み な ら ず, リ ザ ー バ ー と し て electronic mobile を adjust す る こ と が in stopping さ れ た.

项目成果

K.Saiki,T.Mogi,and Y.Anraku: "Probing a role of subunit IV of the Escherichia coli bo-type ubiquinol oxidase by deletion and cross-linking analyses." J.Biol.Chem.271. 15336-15340 (1996)

K.Saiki、T.Mogi 和 Y.Anraku：“通过缺失和交联分析探讨大肠杆菌 bo 型泛醇氧化酶的 IV 亚基的作用。”

M.Tsubaki,T.Mogi,H.Hori,M.Sato-Watanabe,and Y.Anraku: "FT-IR and EPR studies on cyanide-bindings to the heme-copper binuclear center of cytochrome bo-type ubiquinol oxidase from Escherichia coli:Release of CuB-cyano complex in the partially reduced states

M.Tsubaki、T.Mogi、H.Hori、M.Sato-Watanabe 和 Y.Anraku：“埃希氏菌细胞色素 bo 型泛醇氧化酶的血红素铜双核中心氰化物结合的 FT-IR 和 EPR 研究

H.Hori,M.Tsubaki,T.Mogi,and Y.Anraku: "EPR and NO complex of bd-type ubiquinol oxidase from Escherichia coli.The proximal ligand of heme d is a nitrogenous amino acid residue." J.Biol.Chem.271. 9254-9258 (1996)

H.Hori、M.Tsubaki、T.Mogi 和 Y.Anraku：“来自大肠杆菌的 bd 型泛醇氧化酶的 EPR 和 NO 复合物。血红素 d 的近端配体是含氮氨基酸残基。”

K.Sakamoto,H.Miyoshi,K.Takegami,T.Mogi,Y.Anraku,and H.Iwamura: "Probing substrate binding site of the Escherichia coli quinol oxidases using synthetic ubiquinol analogues based upon their electron-donating efficiency." J.Biol.Chem.271. 29897-29902 (1996)

K.Sakamoto、H.Miyoshi、K.Takegami、T.Mogi、Y.Anraku 和 H.Iwamura：“根据其给电子效率，使用合成泛醇类似物探测大肠杆菌醌醇氧化酶的底物结合位点。”