ランダム変異を用いたリゾチームのフォルディング情報の解析

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本研究は、ランダム変異リゾチームをスクリーニングし、蛋白質のフォルディングに関与している残基のマッピングを行うことで、高次構造又は2次構造のどの辺はどのような変換が可能か又は不可能かについての情報を蓄積することを目的としている。そのため、酵母から分泌できないリゾチームをランダムライブラリーからスクリーニングした。すなわち、既に確立しているストレプトマイシン依存性大腸菌を用いたクローニング方法と、活性及びELISAによるスクリーニング系により、活性及び分泌量の減少したものを選び出した。DNAシークエンスの結果、2変異体Asp18His/Leu25ArgおよびAla42Val/ser50Ile/leu56Glnが得られた。これらの変異体を既に開発済みの大腸菌の発現系で生産・単離し、尿素及びグリセロール存在下でin vitroでの巻き戻しを行い、陽イオン交換HPLCにより解析した結果、両変異体ともその変異が原因で不安定となったため酵母から分泌しなかったと考えられた。さらに、これらの変異体のそれぞれの1アミノ酸変異体を作製し同様な解析を行った。この結果、Leu25ArgとLeu56Glnがその不安定さに寄与していて、それ以外の変異は野生型と同様な傾向を示した。このように、多重変異体が得られた場合、それぞれの1アミノ酸変異体を作製し解析することは必要であると思われる。以後、さらにスクリーニングを続けていく予定である。