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分断型アラニンラセマーゼの分子構造形成における細胞内マトリツクスの相互作用

丙氨酸消旋酶碎片分子结构形成中的细胞内基质相互作用

基本信息

批准号：
07229229
负责人：
左右田健次
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至 1995
项目状态：
已结题

项目摘要

好熱菌由来のアラニンラセマーゼのサブユニットは、2次構造予測から2つのドメインよりなるものと推測される。両ドメインを遺伝子工学的に別々に発現させた場合、補酵素PLPを結合部位を含む、N-末端ドメインタンパク質(N-フラグメント)がinclusion bodyを形成して宿主大腸菌の不溶性の画分に回収されたのに対して、C-フラグメントは発現しなかった。しかし両者を異なるベクター上で共発現させた場合には、α2β2構造を持ち、野生型酵素の約50%の活性を示す分断型酵素が得られた。また大腸菌由来の分子シャペロンであるgroESLを共発現させた場合にはN-フラグメントは宿主E. coliの可溶性画分にえられ、ラセマーゼ活性を示した。またin vitroにおける変性N-フラグメントのリフォルディングを検討したところ、C-フラグメントまたはシャペロンGroESLとともにリフォルディングさせた場合のみラセマーゼ活性を示した。以上の結果はアラニンラセマーゼにおいてはN-末端ドメインがその活性発現に関与し、C-末端ドメインは酵素のフォルディングを助けるいわば分子内シャペロンとして働いていることを意味する。X線解析による立体構造解析の結果では、本酵素のサブユニットは大小2つのドメインから形成されるが、そのヒンジ部分の位置は予想されたドメイン領域より20残基程度N-末端側に位置した。予想されたN-末端ドメインはα,β-バレル構造をもつコアの部分と一対の逆平行β構造をもつ領域からなり、補酵素PLPはα, β-バレル構造の中心に位置している。C-末端ドメインはN-末端ドメインの突きだした部分に巻き付くように存在する。PLPを中心とする活性部位近傍には、C-末端ドメインに属する残基はほとんど存在せず、N-末端ドメインがラセマーゼの活性発現に関与するという本研究で結果を支持した。

The origin of the hot bacteria is predicted by the second order structure prediction. In the case where the enzyme PLP binding site is included, the N-terminal protein is formed into an inclusion body, and the insoluble fraction of host Escherichia coli is recovered, the C-terminal protein is recovered. In addition, the α2β2 structure was maintained and about 50% of the activity of wild-type enzyme was observed. E. coli is a member of the molecular family. coli soluble fraction, the activity of which is shown below. In the vitro, the N-type and C-type materials are used to make the materials more flexible. These results indicate that the activity of N-terminal and C-terminal enzymes is related to the development of intracellular enzymes. X-ray analysis of the results of the three-dimensional structure analysis showed that the enzyme was formed from 2 residues in size, and the position of the enzyme was expected to be 20 residues in the N-terminal position. It is expected that the N-terminal structure will be located in the center of the α,β-structure and the antiparallel β structure will be located in the center of the α, β-structure. The C-terminal part of the N-terminal part of the The results of this study support the existence of residues near the active site of PLP and its N-terminal residues.