ランダム変異を用いたリゾチームのフォルディング情報の解析

蛋白質のフォルディングの情報を解読する目的で以下の実験を行った。(1)巻き戻り現象を明確に把握するために、巻き戻しの基本的方法論を確立した。(2)ランダム変異体を能率良く確実に選び出すために、ストレプトマイシン依存性の菌を用いて100%リゾチーム遺伝子が入った大腸菌のみをポジディイブ選択できる系を確立した。(3)リゾチームをいくつかの領域に分けて平均1個の変異が入るようなランダムオリゴヌクレオチドを張り付けてランダム変異体を作製する。酵母の分泌系でリゾチームを分泌しないもをまずは選び出す。第一選択はリゾチーム活性による溶菌斑を示さないものを選ぶ。次いで少量培養後、ELISAでリゾチームが全く分泌されないものに絞り込む。この段階でDNA配列を解析する。さらにこのリゾチーム遺伝子を大腸菌の発現系に移して発現させ、巻き戻り効率を検討する。以上の解析系を確立した。(4)リゾチームの約1/3の領域について5000個以上の変異体の選択を完了した。現在のところ目的の変異体としては、2個以上の変異が入ったものしか捕まっていない。単一変換体に戻して、これら1個ずつの変換の重要性を検討している。一方、巻き戻りに関して決定的と思われる変換を意図的に施して解析することにより、情報を増やす研究も強力に押し進めている。

蛋白質のフォルディングの情報を解読する目的で以下の実験を行った。(1)巻き戻り現象を明確に把握するために、巻き戻しの基本的方法論を確立した。(2)ランダム変異体を能率良く確実に選び出すために、ストレプトマイシン依存性の菌を用いて100%リゾチーム遺伝子が入った大腸菌のみをポジディイブ選択できる系を確立した。(3)リゾチームをいくつかの領域に分けて平均1個の変異が入るようなランダムオリゴヌクレオチドを張り付けてランダム変異体を作製する。酵母の分泌系でリゾチームを分泌しないもをまずは選び出す。第一選択はリゾチーム活性による溶菌斑を示さないものを選ぶ。次いで少量培養後、ELISAでリゾチームが全く分泌されないものに絞り込む。この段階でDNA配列を解析する。さらにこのリゾチーム遺伝子を大腸菌の発現系に移して発現させ、巻き戻り効率を検討する。以上の解析系を確立した。(4)リゾチームの約1/3の領域について5000個以上の変異体の選択を完了した。現在のところ目的の変異体としては、2個以上の変異が入ったものしか捕まっていない。単一変換体に戻して、これら1個ずつの変換の重要性を検討している。一方、巻き戻りに関して決定的と思われる変換を意図的に施して解析することにより、情報を増やす研究も強力に押し進めている。