変異体を用いたリゾチームの構造構築過程の解析

利用突变体分析溶菌酶的结构构建过程

• 批准号: 09261228
• 负责人: 井本 泰治
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09261228/
• 关键词: タンパク質; リゾチーム; フォルディング; 変異タンパク質; 構造形成機構; 再生反応

リゾチームが還元状態からどのような道筋で再生するかを変異体を用いて解析した。Trp62をGlyへ置換した変異体を用いて還元状態から再生実験を行った。野生体は再生反応を開始した後速やかに活性の発現が認められた。一方、変異体においては再生反応開始直後から約1分間活性を発現しなかったが、その後野生体に比べゆっくりした速度で再生した。そこで、野生体及び変異体を1分、3分、5分及び30分間再生反応した後、ヨード酢酸を用いて遊離のチオール基をトラップし、ゲルクロマトグラフィーを用いてどのような大きさの分子種が生成しているかを調べた。野生体に比べ変異体では、再生反応開始直後にサイズの大きな分子種のポピュレーションが明らかに増加していた。この結果から、Trp62をGlyに変えたことでリゾチーム内の単独で構造を形成し得るペプチドAsn59からMet105を含む領域の構造形成が遅くなっており、変性構造を持つ分子種のポピュレーションが増加していることがわかった。このことを明確にするために、上述したトラップ時間において得られた生成物をトリプシン消化し、逆相HPLCによりジスルフィド結合の形成を解析した。この変異体においてもジスルフィド結合の形成される順序は野生体と同一であったが、再生1分後のそれらの生成量は、野生型に比べ明らかに低下していた。以上の結果から、Trp62のGlyへの変異体において、再生初期の構造(おそらくペプチドAsn59からMet105を含む領域)形成が非常に遅くなったと結論した。即ち、リゾチームの還元状態からの再生過程において、まずペプチドAsn59からMet105領域が形成し、その後これ以外の領域が形成することが強く示唆された。

リ ゾ チ ー ム が also yuan state か ら ど の よ う な tao jin で regeneration す る か を - variant を with い て parsing し た. Trp62をGlyへ to replace the <s:1> た variant を to reduce the state by て て ら to regenerate experiments を to った. In the wild, <s:1> regeneration reaction 応を begins た and then rapidly や に に activity <s:1> occurs が recognition められた. Side, - variant に お い て は regeneration against 応 start straight after か ら about 1 minute between active を 発 now し な か っ た が, そ の wild body after に than べ ゆ っ く り し た speed で regeneration し た. そ こ で, wild body and び - variant を 1, 3, 5 and び 30 between regeneration against 応 し た, ヨ ー ド を boggy acid with い て free の チ オ ー ル base を ト ラ ッ プ し, ゲ ル ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を with い て ど の よ う な big き さ の molecules of が generated し て い る か を adjustable べ た. Wild body に than べ - variant で は, regeneration against 応 start straight after に サ イ ズ の big き な molecules of の ポ ピ ュ レ ー シ ョ ン が Ming ら か に raised plus し て い た. こ の results か ら, Trp62 を Gly に - え た こ と で リ ゾ チ ー ム within の 単 を で structure form し alone have る ペ プ チ ド Asn59 か ら Met105 を の が structure formation containing む field 遅 く な っ て お り, - structure を with つ molecular の ポ ピ ュ レ ー シ ョ ン が raised plus し て い る こ と が わ か っ た. こ の こ と を clear に す る た め に, the above し た ト ラ ッ プ time に お い て have ら れ た products を ト リ プ シ ン digestion し, reverse phase HPLC に よ り ジ ス ル フ ィ ド combined の form analytical し を た. こ の - variant に お い て も ジ ス ル フ ィ ド combined の form さ れ る order は wild body と same で あ っ た が, regeneration after 1 minute の そ れ ら の generation は, wild type に than べ Ming ら か に low し て い た. の above results か ら, Trp62 の Gly へ の - variant に お い て early, regeneration の structure (お そ ら く ペ プ チ ド Asn59 か ら Met105 を む field) form が に 遅 く な っ た と conclusion し た. ち, リ ゾ チ ー ム の is yuan state か ら の regeneration process に お い て, ま ず ペ プ チ ド Asn59 か ら Met105 が form し, そ の after こ れ outside の field が formed す る こ と が く and shown strong sucking さ れ た.

项目成果

Tadashi Ueda: "Favourable interaction between heavy and light chains arrests the undesirable oligomerization of heavy chains in the refolding of denatured and reduced immunogloblin G." Cell.Mol.Life Sci.53・11/12. 929-934 (1997)

Tadashi Ueda：“重链和轻链之间的有利相互作用阻止了变性和还原的免疫球蛋白 G 重折叠中不需要的重链寡聚化。”Cell.Mol.Life Sci.53·11/12 (1997)。

Sohei Mine: "Improvement of the refolding yield and solubility of hen egg-white lysozyme by altering Met residue attached to its N-terminal to Ser." Protein Eng.10・11. 1333-1338 (1997)

Sohei Mine：“通过将连接到其 N 末端的 Met 残基改为 Ser 来提高鸡蛋清溶菌酶的重折叠产量和溶解度。” Protein Eng.10・11（1997）。

Yoshito Abe: "Detection of a local interaction of hen lysozyme under highly denaturing conditions using chemically ^<13>C-enriched methionine vesonance" J.Biochem.123・2. 313-317 (1998)

Yoshito Abe：“使用化学^ 13 C富集的蛋氨酸vesonance检测高度变性条件下母鸡溶菌酶的局部相互作用”J.Biochem.123·2（1998）。