ショウジョウバエ幼虫中枢神経系培養細胞株を用いた変態期におけるアポトーシスの研究

利用果蝇幼虫中枢神经系统细胞系研究变态过程中的细胞凋亡

• 批准号: 08276214
• 负责人: 程 久美子
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08276214/
• 关键词: Drosophila; DNA fragmentation; Ca^<2+>; 神経細胞死; 培養細胞株; Apoptosis; 中枢神経系; 細胞内情報伝達系

変態期の昆虫の中枢神経系では神経回路網の再構築がおこるが、その機構にアポトーシスが関与している可能性が高い。したがって、アポトーシスの分子機能を解析することは、変態時の神経系再構築機構を解明する上で重要である。しかし、幼虫の中枢神経系から細胞死をおこす細胞を生化学的材料として用いることは、量的、方法論的に難しい。そこで、私達は、ショウジョウバエ幼虫中枢神経系からクローン細胞株を樹立し、これらを用いてアポトーシスの機構を解析する手法をとった。ショウジョウバエ幼虫中枢神経系から樹立したクローン細胞株のうち、昆虫の神経細胞特異的マーカーである抗HRP抗体に陽性で、神経伝達物質であるアセチルコリンの含量が多く、種々の神経ペプチドやアミノ酸を含有しているML-DmBG2-c2細胞株を主に用いた。この細胞株は、A23187(カルシウムイオノフォア)、H-7(プロテインキナーゼ阻害剤)、ニコチンアミド(poly(ADP-ribose)polymerase阻害剤)、アクチノマイシンD、シクロヘキシミド(RNA、タンパク合成阻害剤)によって、クロマチンの凝集、DNAのヌクレオソーム単位での断片化を伴うアポトーシスが誘導される。これらの薬物のうち、A23187,H-7によるアポトーシスの細胞内分子シグナルカスケードをより詳細に解析するために、細胞膜透過性、非透過性Ca^<2+>キレーター(BAPTA)、Ca^<2+>-dependent endonuclease阻害剤(aurintricarboxylic acid(ATA))、Ca^<2+>/calmodulin regulated enzyme阻害剤(W-7)、interleukin-1β converting enzyme(ICE)阻害剤、CPP32阻害剤の効果をDNAの断片化を指標に検討した。また、H-7はprotein kinase C(PKC),protein kinase A(PKA),cGMP-dependent protein kinase(PKG),myosin light chain kinase(MLCK),casein kinasel(CKI)の阻害剤であるが、この内、どのkinaseがH-7によるアポトーシスに関わっているかを、それぞれの特異的阻害剤であるcalphostin C,H-89,ML-9,CKI-7を用いて解析した。A23187によるアポトーシスは、細胞膜透過性、非透過性BAPTA、ATA、ICE阻害剤によって阻害された。この結果は、A23187が、細胞外からのCa^<2+>の流入を引き起こし、ICE様proteaseを活性化することを示している。さらに、この時に、Ca^<2+>-dependent endonucleaseによってDNAのヌクレオソーム単位での断片化がおこることが示唆された。一方、H-7によるアポトーシスは、細胞膜透過性BAPTA、W-7、ICE阻害剤、CPP32阻害剤によって阻害された。しかし、calphostin C,H-89,ML-9,CKI-7はアポトーシスを誘導しなかったので、H-7は、主に阻害するとされるPKC,PKA,PKG,MLCK,CKI以外のH-7-sensitive substanceを標的としていることが示された。よって、H-7は、未同定のH-7-sensitive substanceを阻害することにより、ICE様、CPP32様proteaseを活性化してアポトーシスを誘導し、この時にCa^<2+>/calmodulin regulated enzymeが関与することが示唆された。さらにDNAの断片化は、ATAでは阻害されないendonucleaseによっておこると考えられた。以上のことから、ショウジョウバエの細胞においては、少なくとも2種類以上の異なるアポトーシスのカスケードが存在すると考えられる。

The central nervous system of insects in different stages has a high possibility of reconstructing the neural loop network, and the mechanism of the system has a high possibility of changing. The molecular function analysis of the protein and protein is very important for understanding the mechanism of the re-construction of the protein and protein system. The central nervous system of larvae and larvae is characterized by cell death and biochemical materials, quantitative and methodological difficulties. The method of establishing cell lines and analyzing the mechanism of cell lines in the central nervous system The central nervous system of the larvae was established in cell lines, and insect neurocyte-specific antibodies were positive for anti-HRP antibodies, and the content of neurotransmitters was high. The ML-DmBG2-c2 cell line was mainly used in the establishment of the central nervous system. These cell lines were induced by A23187, H-7, poly(ADP-ribose)polymerase inhibitor, A23187, S23187, S23187. Cell membrane permeable, impermeable Ca^<2+>-dependent endonuclease inhibitor (BAPTA), Ca^<2 +>-dependent endonuclease inhibitor (aurtricarboxylic acid(ATA)), Ca^<2+>/calmodulin regulated enzyme inhibitor (W-7), interleukin-1β converting enzyme(ICE) inhibitor, CPP32 inhibitor and DNA fragmentation index. H-7 protein kinase C(PKC),protein kinase A(PKA),cGMP-dependent protein kinase(PKG),myosin light chain kinase(MLCK),casein kinase (CKI) inhibitors are analyzed using calphostin C,H-89,ML-9,CKI-7. A23187 is a barrier to cell membrane permeability, non-permeability, BAPTA, ATA and ICE. The results were as follows: A23187, extracellular Ca^<2+> influx, ICE protein activation In addition, the time limit, Ca^<2+>-dependent endonuclease, DNA fragmentation, and DNA fragmentation are also discussed. One side, H-7, ICE, CPP32, etc. H-7-sensitive substance labeled PKC,PKA,PKG, MLCK,CKI and H-8-sensitive substance labeled PKC, PKG, MLCK, CKI and H-8-sensitive substance labeled PKC, PKG,MLCK,CKI and H-8-sensitive substance labeled PKC,PKG,MLCK,CKI. H-7, H-7-sensitive substance, ICE, CPP32-protein activation, Ca^<2+>/calmodulin regulated enzyme, Ca^<2+>/calmodulin regulated enzyme. DNA fragmentation, ATA inhibition, endonuclease inhibition More than two kinds of different types of cells exist.

项目成果

Suzuki,H.: "Effects of protein kinase inhibitors on survival of motoneurons in chick embryos in vitro." Neurosci.Res.Suppl.20. S131 (1996)

Suzuki,H.：“蛋白激酶抑制剂对体外鸡胚运动神经元存活的影响。”

Nagano,M.: "A protein kinase inhibitor,H-7,induces apoptosis in a Drosophila neuronal cell line." Neurosci.Res.Suppl.20. S137 (1996)

Nagano,M.：“一种蛋白激酶抑制剂 H-7 可诱导果蝇神经细胞系凋亡。”

Ui-Tei,K.: "Induction of apoptosis in a Drosophila neuronal cell line by calcium ionophore." Neurosci.Lett.203. 191-194 (1996)

Ui-Tei,K.：“钙离子载体诱导果蝇神经细胞系凋亡。”

Ui-Tei,K.: "Differentiation and transdetermination of cultured Drosophila imaginal disc cells." In Vitro.Cell.Dev.Biol.-Animal. 32. 524-527 (1996)

Ui-Tei,K.：“培养的果蝇成虫盘细胞的分化和转决定。”