アセチルコリン受容体とNa^+,K^+-ATPaseの細胞膜上での局在化の制御機構…ナノメートル計測-ピコニュートン操作法による1分子レベルでの解析による研究

细胞膜上乙酰胆碱受体和Na^+,K^+-ATP酶定位的控制机制...利用皮克顿操作方法进行单分子水平纳米测量和分析的研究

• 批准号: 09257210
• 负责人: 楠見 明弘
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09257210/
• 关键词: 細胞骨格; 金コロイド; 光ピンセット; Na^+; K^+-ATPase

Na^+,K^+-ATPaseに金コロイドを抗体を介して結合させた。それらの運動を細胞の自由表面上で一分子レベルで観察し、さらに、光ピンセットを用いて牽引して、それに対する応答を調べた。その結果、約20%が細胞骨格結合型であること、約80%の分子は、細胞骨格非結合型で、膜骨格フェンスで仕切られたコンパートメント間をホップしていく様な拡散運動をしていることが示された。本研究に用いた上皮細胞MDCKは、1.8mM程度のCa^<2+>を含む通常の培養液中で培養すると細胞間に接着構造を形成する。Na^+,K^+-ATPaseは、細胞膜のラテラル面に局在する。ところが培養液のカルシウム濃度を50μM程度に下げると、接着構造は失われ、Na^+,K^+-ATPaseは細胞表面に一様に存在するようになる。再度、培養液のカルシウム濃度を通常のカルシウム濃度に戻すと(カルシウムスイッチと呼ぶ)、同期的に細胞間の強い接着が回復し、細胞は極性をもつようになり、Na^+,K^+-ATPaseは再びラテラル面に集合する。この集合の過程を1分子レベルで追跡することによって、集合の機構を解明することを目指した。しかし、2時間観察しても、追跡しているNa^+,K^+-ATPaseはなかなかラテラル面に移動しなかった。光の細胞毒性、金コロイドによるクロスリンクなどが原因と考えられ、現在、この問題の解決に全力をあげている。今後は、カルシウムスイッチによって誘起される、Na^+,K^+-ATPaseのラテラル面への集合を一分子レベルで追跡する、また、集合時に細胞からかかる力の性質を決定する、などを行い、これらによって、Na^+,K^+-ATPaseのラテラル面への局在化の機構を明らかにしたい。

Na^+,K^+-ATPase A molecule on the free surface of a moving cell can be detected and modulated by light. The results showed that about 20% of the molecules were cell-bone-bound and about 80% of the molecules were cell-bone-non-bound. In this study, MDCK cells were cultured in normal medium containing Ca <2+> at 1.8 mM to form intercellular structures. Na^+,K^+-ATPase plays a key role in cell membrane activation. The concentration of Na^+,K^+-ATPase in the culture medium was 50μM. Again, the culture medium concentration is usually different from the concentration of the culture medium, the strong intercellular recovery at the same time, the polarity of the cells is different, and Na^+,K^+-ATPase is concentrated in the culture medium. The process of aggregation is a molecular process, and the mechanism of aggregation is an objective process. Na^+,K^+-ATPase is moving in two different directions. Light Cytotoxicity, Gold, Light, Light In the future, Na^+, K ^+-ATPase's concentration will be determined by molecular tracing, molecular force determination, and molecular mechanism analysis.

项目成果

Y. Sako.: "Comparison of two-photon excitation laser scanning fluorescence microscopy with UV-confocal laser scanning fluorescence microscopy" J.Microscopy. 185. 9-20 (1997)

Y. Sako.：“双光子激发激光扫描荧光显微镜与紫外共焦激光扫描荧光显微镜的比较”J.Microscopy。

A.Kusumi.: "Application of laser tweezers to studies of the fences and tethers of the membrane skeleton which regulate the movements of plasma membrane proteins." Methods Cell Biol."Laser Tweezers" ,M.P.Sheetz,Ed.173-194 (1997)

A.Kusumi.：“应用激光镊子研究调节质膜蛋白运动的膜骨架的栅栏和系链。”

Y.Sako.: "Cytoplasmic regulation of the movements of E-cadherin in the plasma membrane as studied by optical tweezers and single particle tracking." J.Cell Biol.in press.

Y.Sako.：“通过光镊和单粒子跟踪研究质膜中 E-钙粘蛋白运动的细胞质调节。”