カイコ前胸腺刺激ホルモンの立体構造解析と機能相関

家蚕前胸激素的结构分析及功能关系

• 批准号: 09265219
• 负责人: 永田 宏次
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09265219/
• 关键词: 前胸腺刺激ホルモン(PTTH); 巻きもどし; NMR; 結晶化

大腸菌で発現したPTTHの大規模精製系の確立-6xHis-tev-PTTHはPTTHの発現の場合と同じく封入体を形成した。従来法では、PTTHの封入体を8M尿素で可溶化した後、透析して巻き戻していたが、分子会合・沈殿を抑えるためにPTTH濃度を低くする必要があった(【less than or equal】30 μg/ml)。それゆえ、大容量の希薄タンパク質溶液を扱うこの方法は、大量調製には不向きであった。そこで、タンパク質間相互作用を抑えるために、6xHis-tev-PTTHをNi-NTA agaroseに結合させた状態で巻き戻したところ、6xHis-tev-PTTHが1mg/mlの高濃度であっても、会合・沈殿を抑えて、目的のホモダイマーを主産物として得ることができた。したがって従来法の1/30の液量で巻き戻しが可能になり、大腸菌で発現したPTTHの大量調製が効率的に行えるようになった。発現PTTHの大量調製法が確立したので、今後、結晶化条件の検討をPTTHの2D^1_-HNMR解析-NMR法による立体構造解析は、結晶化を必要とせず、さらに、比較的初期に二次構造を決定できるので、X線結晶構造解析と相補的な構造解析手段である。NMR法によるPTTHの立体構造解析を進めるために、H_2O(pH6.0、HCI添加によりpH調整)に溶解した2mMPTTHの2D^1_-HNMRを測定した。broadなNMRシグナルとsharpなものが混在することから、PTTH分子がrigidなコア構造とflexibleな周辺部からなることが明らかになった。スペクトルの質から、安定同位体(^<13>C,^<15>N,^2H)標識PTTHを用いることで、NMR法による構造決定が可能なことが示された。

Establishment of a large-scale purification system for the development of E. coli PTTH-6xHis-tev-PTTH In addition, PTTH encapsulation is soluble in 8M urea, dialysis is necessary to reduce the concentration of PTTH (less than or equal to 30 μg/ml). The method of preparing high-volume solutions is to prepare a large number of solutions. 6xHis-tev-PTTH and Ni-NTA agar are bound to each other at a high concentration of 1mg/ml. 1/30th of the total amount of liquid in the preparation method can be used for the preparation of PTTH. The bulk modulation method for PTTH discovery is used to determine the crystallization conditions, and the 2D^1-HNMR analysis-NMR method is used to analyze the three-dimensional structure, determine the crystallization conditions, determine the initial secondary structure, and determine the X-ray crystal structure. NMR analysis of PTTH stereostructure, H_2O(pH 6.0, HCI addition, pH adjustment), dissolution of PTTH and 2D ^1-H NMR determination. broad NMR sharp sharp The identification of PTTH by mass and stable isotopes (^<13>C,^<15>N,^2H) is possible by NMR method.