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複数のジスルフィド結合を含む組換タンパク質の高効率巻き戻し系の確立と立体構造解析

含多个二硫键重组蛋白高效解旋体系的建立及三维结构分析

基本信息

批准号：
14780470
负责人：
永田宏次
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

平成14年度は、ジスルフィド結合を3対含むタンパク質の巻き戻し系を確立することに成功した。平成15年度は、その巻き戻し系を用いて試料調製した抗菌ペプチド、オリクチンの立体構造をNMR法により決定した。また同時に、ジスルフィド結合を7対含むタンパク質、前胸腺刺激ホルモンの巻き戻し系の検討を進めた。前胸腺刺激ホルモンを大腸菌で発現させたところ、不溶性の封入体を形成した。通常用いられる大腸菌株BL21(DE3)Star(Invitrogen)に加え、細胞内でのジスルフィド形成が可能な大腸菌の変異株Rosetta-gami B(DE3)(Novagen)も宿主として生産を試みたが、あらゆる条件で不溶性の封入体を形成した。それゆえ、可溶化と巻き戻しについて、種々の条件検討を行った結果、6Mグアニジン塩酸塩による変性・可溶化、その後の希釈法巻き戻しによる立体構造形成により、大部分の前胸腺刺激ホルモンポリペプチド鎖が天然型と同じ二量体を形成することが明らかになった。その後、2段階のカラムクロマトグラフィーにより、この巻き戻し前胸腺刺激ホルモンを精製し、生物活性検定に供したところ、標品と同等の比活性を有した。このように、ジスルフィド結合を7対含むタンパク質、前胸腺刺激ホルモンの立体構造形成にも成功することができた。現在、この巻き戻しにより得られた前胸腺刺激ホルモンをもちいて結晶化実験を行っており、今後、X線結晶構造解析による立体構造解析を進める予定である。

In 2014, the company successfully established a three-year-old business model. In 2015, the three dimensional structure of the sample was determined by NMR At the same time, we will discuss the relationship between 7 kinds of drugs and 7 kinds of drugs. Pre-thymus stimulating cells were found in Escherichia coli and an insoluble enclosure was formed. Coliform strain BL21 (DE3)Star(Invitrogen) is usually used to form an insoluble enclosure under conditions that allow the formation of an intracellular isolate of Coliform strain Rosetta-gami B(DE3)(Novagen). The results of the study of the conditions for the formation of the three-dimensional structure of the 6M prothymic acid, the solubility of the 6M prothymic acid, and the formation of the three-dimensional structure of the 6M prothymic acid, the solubility of the 6M After the first two stages, the first two stages of the first three stages of the second stage of the second stage of the third stage of the second stage of the third stage of the third 7. The formation of three-dimensional structures containing thymic substances and prothymic stimuli Now, this is the first time we have obtained the results of pre-thymus stimulation. In the future, X-ray crystal structure analysis and three-dimensional structure analysis will be carried out.