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膜タンパク質の高効率立体構造解析をめざした発現系作成から結晶化までのシステム構築

从表达系统创建到结晶的系统构建，用于高效膜蛋白三维结构分析

基本信息

批准号：
17681026
负责人：
永田宏次
金额：
$ 19.55万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17681026/
关键词：
membrane protein Thermus thermophilus Aeropyrum pernix high-throughput expression structural genomics

项目摘要

平成18年度は、平成17年度に引き続き原核生物の膜タンパク質を大腸菌を宿主として発現させる系について検討する一方で、新たに真核生物の膜タンパク質を酵母を宿主として発現させる系について検討した。原核生物の膜タンパク質については、好熱細菌Thermus thermophilusと好熱古細菌Aeropyrum pernix岳の膜タンパク質、各53個、計106個について、pBAD(araBADプロモーター、Invitrogen)とpET-Mistic(T7プロモーター、枯草菌Bacillus subtilis由来の4回膜貫通型膜タンパク質Mistic(Roosild et al.,2005)との融合タンパク質発現ベクター、Novagen製品を改変)とに組み込むことを計画したが、一部の膜タンパク質遺伝子のベクターへの導入に難航し、結局pBADベクターに27個の膜タンパク質遺伝子を組み込み、その発現確認実験を行った。その結果、Flagタグ抗体を用いたWestern blotで、27個のうち15個の膜タンパク質について発現が確認された。特に、複数の輸送体膜タンパク質の発現量が非常に高いことが示され、結晶化用試料の調製が可能になった。真核生物の膜タンパク質については、ヒト、カイコガ、線虫、シロイヌナズナ、酵母の膜タンパク質、約50個を対象とした。膜タンパク質発現量の確認を効率のよく行うため、[α-mating factorのシグナル配列]-[膜タンパク質]-[GFP]を酵母S.cerevisiaeで発現させるベクターを構築した。現在、上記真核生物の膜タンパク質の発現確認を進めている。

In 2018 and 2017, the development of prokaryotic membrane proteins and Escherichia coli hosts was discussed. In 2017, the development of eukaryotic membrane proteins and yeast hosts was discussed. Prokaryote membrane types include 53 membrane types each, 106 membrane types, pBAD(araBAD), Invitrogen), pET-Mistic(T7), Bacillus subtilis derived from 4-loop membrane types, Thermus thermophilus and Aeropyrum pernix (Roosild et al., 2005) The integration of 27 membrane components into Novagen's product development plan and Novagen's product development plan was completed. The results showed that 15 of the 27 samples were identified by Western blot. In particular, the amount of emission of a plurality of carrier films is very high, indicating that the preparation of crystallization samples is possible. Eukaryotic membrane proteins, such as yeast, etc. The efficiency of membrane quality production was confirmed by the construction of [α-mating factor]-[membrane quality]-[GFP] yeast S.cerevisiae. Now, the identification of eukaryotic membrane formation and quality development is reported.