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ヌクレオチド除去修復による遺伝情報維持と細胞機能制御機構

核苷酸切除修复的遗传信息维持和细胞功能控制机制

基本信息

批准号：
12143207
负责人：
菅澤薫
金额：
$ 22.53万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞の紫外線照射に伴い、C群色素性乾皮症(XPC)タンパク質がUV-DDB依存的にユビキチン化されることを昨年までに明らかにした。細胞抽出液からの共免疫沈降実験、および精製タンパク質を用いたin vitroでの結合実験から、XPCとUV-DDBが直接物理的に相互作用することが示された。また、DDB1、DDB2に加えてcullin 4A、Roc1を昆虫細胞で同時に発現させることにより、ユビキチン・リガーゼ活性を持つUV-DDB-E3複合体を精製し、これを用いてXPCのユビキチン化反応を無細胞系で再構成することに成功した。この反応系ではXPCだけでなく、DDB2とcullin 4Aもユビキチン化の基質となるが、紫外線照射した細胞ではXPCのユビキチン化が可逆的であるのに対して、DDB2は速やかに分解されることがわかった。すなわち、XPCとDDB2は共通のE3によってユビキチン化されるにもかかわらず、その細胞内での運命が大きく異なることが明らかになった。一方、XPCと複合体を形成するcentrin 2の機能を解析するため、まずXPCにおけるcebtrin 2結合領域を同定した。この結合領域に3か所のアミノ酸置換を導入することによってcentrin 2との結合能を欠く変異XPCを作成した。この変異XPCは細胞内、および無細胞系において、野生型XPCと比較してヌクレオチド除去修復における活性が有意に低下していた。精製タンパク質を用いた生化学的な解析により、centrin 2は複合体形成を介してXPCの損傷DNA結合活性を増強し、それによって修復反応を促進することが示された。

Xeroderma pigmentosum C (XPC) is caused by UV irradiation of cells. Xeroderma pigmentosum C is caused by UV irradiation of cells. Cell extracts contain co-immuno-sedimentation, purification, and purification. XPC and UV-DDB interact directly in vitro. DDB1, DDB2, cullin 4A and Roc1 were added to insect cells and simultaneously developed. The UV-DDB-E3 complex was purified and successfully reconstructed in a cell-free system using XPC. The reverse reaction system is XPC, DDB2 and cullin 4A. The substrate is converted into XPC by ultraviolet irradiation. The reverse reaction system is converted into XPC by ultraviolet irradiation. DDB2 is decomposed into XPC by ultraviolet irradiation. XPC and DDB2 communicate with each other in E3 and operate in different cells. XPC and Cebtrin 2 have the same function. The binding domain 3 contains all of the acid substitutions. The binding domain 2 contains all of the acid substitutions. The activity of XPC in intracellular, non-cellular and wild-type cells was intentionally reduced compared with that of XPC in vitro. Purified DNA is used for biochemical analysis, centrin 2 complex formation, enhancement of damaged DNA binding activity, and promotion of repair reactions.