C群色素性乾皮症(XPC)蛋白質の構造と機能

C 族着色性干皮病 (XPC) 蛋白的结构和功能

• 批准号: 10780432
• 负责人: 菅澤 薫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780432/
• 关键词: XPC蛋白質; ヌクレオチド除去修復; 核移行配列; XPC; TFIIH

前年度までの組換え蛋白質を用いた無細胞系での実験から、C末端の125個のアミノ酸を欠失した変異XPC蛋白質は基本転写因子TFIIHとの相互作用に欠損が見られ、また無細胞ヌクレオチド除去修復反応においても不活性であることが明らかになった。そこで、この変異XPC蛋白質の細胞内での機能を解析する目的で、XP-C群細胞に変異遺伝子を導入して形質転換細胞株を樹立した。間接蛍光抗体染色により、上記のC末端欠失体、およびN末端の117個のアミノ酸を欠いた変異XPCはいずれも正常に核に移行できることを確認した。しかしながら、N末端欠失XPCを発現する細胞で紫外線抵抗性の回復が見られたのと対照的に、C末端欠失XPCを発現する細胞は親株のXPC欠損細胞と同等の紫外線感受性を示した。すなわち、無細胞系の結果と一致して、C末端部分はXPC蛋白質のヌクレオチド除去修復活性の発揮に必須であることが明らかになった。現在、C末端部分についてさらに細かい欠失変異体を作成しており、今後その構造機能相関を解析していく予定である。また、種々の変異XPC蛋白質を一過性に過剰発現して間接蛍光抗体染色を行なうことにより、XPC蛋白質の核移行に関わる配列をN末端付近に2ケ所同定した。XPC蛋白質の活性が翻訳後修飾によって制御されている可能性を調べるため、まずXP-C群細胞にHA、またはFLAGタグを付加したXPC蛋白質のcDNAを導入して形質転換細胞株を単離した。これらの細胞株が正常細胞と同レベルのXPC蛋白質を発現していること、また紫外線抵抗性の回復からタグをつけたXPCが正常な機能を発揮できることを確認した。さらに、FLAGタグが特異的な免疫沈降に非常に有効であることを確かめたので、今後紫外線照射前後でのリン酸化の変動等を解析していく予定である。

直到上一年，使用重组蛋白的无细胞实验表明，在C-末端删除了125个氨基酸的突变XPC蛋白与基本转录因子TFIIH的相互作用有缺陷，并且在细胞无细胞核苷酸的核苷酸切除维修反应中也无效。因此，为了分析该突变XPC蛋白的细胞内功能，通过将突变基因引入XP-C组细胞中建立了转化的细胞系。间接荧光抗体染色证实，N末端缺乏117个氨基酸的C末端缺失和突变XPC都能够成功地转移到核。但是，与表达恢复紫外线抗性的N末端缺失XPC的细胞相反，表达C末端缺失XPC的细胞在亲代菌株中对XPC缺陷型细胞表现出相似的UV敏感性。换句话说，与无细胞结果一致，据表明，C末端部分对于施用XPC蛋白的核苷酸切除修复活性至关重要。目前，我们正在为C端部分创建更详细的缺失突变体，我们计划在将来分析它们的结构和功能相关性。此外，通过瞬时过表达各种突变XPC蛋白和间接荧光抗体染色，在N末端附近鉴定了两个参与XPC蛋白核转运的序列。为了研究XPC蛋白的活性受翻译后修饰调节的可能性，首先通过将XPC蛋白的cDNA用HA或FLAG标签连接到XP-C组细胞中，首先分离出转化的细胞系。已经证实，这些细胞系表达了与正常细胞相同的XPC蛋白水平，并且标记的XPC可以证明由于紫外耐药性的恢复而表现出正常功能。此外，由于已经确认标志标签在特定的免疫沉淀中非常有效，因此我们计划在将来紫外线照射之前和之后分析磷酸化的变化。

项目成果

Yokoi M.et al.: "The xeroderma pigmentosum group C protein complex XPC-HR23B plays an important role in the recruiment of TFIIH to damaged DNA"J.Biol.Chem.. 275(in press). (2000)

Yokoi M.等人：“着色性干皮病 C 组蛋白复合物 XPC-HR23B 在 TFIIH 恢复受损 DNA 中发挥着重要作用”J.Biol.Chem.. 275（出版中）。

Kaoru Sugasawa: "Xerodema pigmentosum group C protein complex is the initiator of global genome nucleotide excision repair" Molecular Cell. 2(2). 223-232 (1998)

Kaoru Sugasawa：“着色性干皮病 C 组蛋白复合物是全球基因组核苷酸切除修复的引发剂”《分子细胞》。

Araki M.et al.: "Reconstitution of damage DNA excision reaction from SV40 minichromosomes with purified nucleotide excision repair proteins"Mutat.Res.. (in press). (2000)

Araki M.等人：“用纯化的核苷酸切除修复蛋白重建 SV40 微型染色体的损伤 DNA 切除反应”Mutat.Res..（出版中）。

Hiyama H.et al.: "Interaction of hHR23B with S5a : the ubiquitin-like domain of hHR23 mediates interaction with S5a subunit of 26S proteasome"J.Biol.Chem.. 274. 28109-28025 (1999)

Hiyama H.等人：“hHR23B与S5a的相互作用：hHR23的泛素样结构域介导与26S蛋白酶体的S5a亚基的相互作用”J.Biol.Chem.. 274. 28109-28025 (1999)