ノックアウトマウスを用いたRasファミリータンパク質の機能解析

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Rasファミリー因子の個体内機能を明らかにする目的で、以下の実験を行なった。Ras抑制性因子Gap1^mノックアウトマウスの作成に関して、組換えアレルを有するES細胞クローンを複数作成し、キメラマウスの作成を行なった。しかし変異アレルをもったF1マウスを研究期間内のうちに得ることができなかった。またカルシウムシグナリングに応答するsmall GTPase Rinのノックアウトマウスを作成したが、顕著な形質変化は見いだせていない。Rasファミリー因子の標的因子として、多くのタンパク質キナーゼが活性化され、さらにシグナルを伝達していくことが示されている。そこで、これらのキナーゼが関与するシグナル伝達系の全貌を明らかにすべく、金属キレートカラムを用いたリン酸化タンパク質の精製と2次元ゲル電気泳動を組合わせることにより、ERKシグナル伝達系の構成因子であるMEK、ERK、RSKの活性化を可視化した。さらに新規ERK基質と考えられる因子の同定を行ない、当該因子が細胞中でERKによりリン酸化されることを明らかにした。これらのERK基質を試験管内でリン酸化し、さらにリン酸化ペプチドを質量分析器で構造解析することにより、基質リン酸化部位の同定を行った。同様のアプローチをp38 MAPキナーゼ系にも応用し、p38 MAPキナーゼカスケードの中でリン酸化される基質を網羅的に検索した。その結果、p38 MAPキナーゼによってリン酸化を受けて活性化されるMAPKAPK-2の基質であるBAG2タンパク質を同定し、そのリン酸化部位を決定した。