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リン酸化プロテオーム解析による腫瘍特異的転写制御機構の解明

通过磷酸蛋白质组分析阐明肿瘤特异性转录控制机制

基本信息

批准号：
17014022
负责人：
服部成介
金额：
$ 3.39万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

リン酸化タンパク質中のリン酸化部位を網羅的に同定するため、ペプチド混合物試料よりリン酸化ペプチドを分離する条件を検討し、Phos-tagカラムを用いることにより従来のIMAC法よりも非特異的吸着の少ない精製系を作成した。この系を利用してHeLa細胞中のリン酸化部位を網羅的に解析し、Hsp27、CDC2キナーゼ、p120RasGAP等約100のリン酸化部位を決定した。このうち約1/3は既報のものであった。ERK基質は30の基質候補を同定し、組替えタンパク質の試験管内におけるリン酸化を確認した。さらに、細胞内でERK活性化にともなってリン酸化されることを確認した。核移行に関与するNup50(nuclear pore complex 50)はERKリン酸化によりimportinβとの相互作用が減弱することを見いだした。p38MAPキナーゼについても同様に基質検索をすすめ、あらたにp50RhoGAPを基質として同定し、試験管内および細胞内においてp38MAPキナーゼによりリン酸化することを認め、さらにそのリン酸化部位を決定した。効率よくキナーゼ基質を同定するため、リン酸化タンパク質を脱リン酸化し、さらに精製キナーゼにより試験管内でリン酸化し、基質同定を行なう実験系を作成した。ERK、p38MAPキナーゼを用いてともに既知の基質がリン酸化されることを見いだした。アミノ酸同位体標識法により定量的に解析する実験系を用いて、野生型Srcおよび細胞膜移行シグナルを欠く変異体Srcのチロシンリン酸化基質の比較を行い、細胞膜に存在する因子のチロシンリン酸化がSrcによる細胞トランスフォーメーション活性に必要なことを見いだした。定量的チロシンリン酸化プロテオーム解析の結果は、チロシン抗体を用いたウェスタンブロットの結果とよく一致していた。

The conditions for the separation of acidified samples from acidified samples were discussed. The nonspecific sorption purification system was prepared by using the IMAC method. This is determined by analyzing about 100 acidified sites in HeLa cells, such as Hsp27, CDC2 and p120RasGAP.このうち约1/3は既报のものであった。The matrix of 30 was identified, and the matrix of 30 was identified. The activation of ERK in cells was confirmed. Nuclear migration is related to Nup50(nuclear pore complex 50) and ERK acidification is related to importinβ interaction. p50RhoGAP is the same substrate as p38MAP, and the same substrate as p38MAP is the same intracellular as p38MAP. For example, if the temperature of the sample is too high, the temperature of the sample will be too high. ERK, p38MAP, p38, p38, p3 The quantitative analysis of Src system using acid isotope labeling method and the comparison of different Src and cell membrane transition factors, the presence of factors in Src and cell membrane transition factors, and the necessary analysis of Src and cell membrane transition factors. The results of quantitative analysis were consistent with those of quantitative analysis.