動物細胞における新たなRasシグナル伝達系の解析

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われわれは、出芽酵母においてRAS1、RAS2およびRAS類似遺伝子RSR1遺伝子を破壊した菌株は致死となり細胞周期のM期で増殖を停止することから、RASタンパク質がcAMP合成酵素の活性を調節し細胞周期G1期の進行を司るだけでなく、細胞周期M期の終了にも関与していることを示した。今年度の本研究においては、以下の実験結果を得た。1.RAS1、RAS2、RSR1三重遺伝子欠損株の増殖を相捕する遺伝子群相互の関係を調べたところ、RAS→LTE1(small GTPaseの活性化因子)→TEM1(small GTPase)→DBF2、CDC5、CDC15(いずれもセリンスレオニンキナーゼ)という情報伝達系が存在することを見いだした。そこでTEM1の温度変異株を作成し、この菌株に酵母細胞内で発現可能なHela細胞およびJurkat細胞由来のcDNAライブラリーを導入し、温度変異株が増殖できない温度での生育を回復する動物細胞由来の遺伝子を単離した。単離したcDNAを決定したところ、hCDC10(中間径フィラメントの構成成分)、nucleolin等の既知の遺伝子の他に新規の遺伝子が単離できた。現在この遺伝子の機能について検討を加えている。2.TEM1タンパク質のGTP結合ドメインは典型的なsmall GTPaseとは異なっているためRASと類似の活性化型変異を作成することは困難であった。そこでTEM1遺伝子内部にPCR反応により無作為に変異を導入し低コピー数の発現でRAS1、RAS2、RSR1遺伝子欠損株の増殖を相捕するTEM1変異遺伝子を単離し、この遺伝子の変異を決定した。