リン酸化プロテオーム解析による腫瘍特異的転写制御機構の解明

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腫瘍特異的リン酸化を明らかにするためには、リン酸化タンパク質を対象としたプロテオミクス技術の開発が必須である。そこで、細胞内リン酸化タンパク質変動を網羅的に解析するため、リン酸化タンパク質の効率よい精製法を確立した。この方法と2次元ゲル電気泳動を組み合わせ、新規のERKおよびp38 MAPキナーゼ基質を多数同定した。新規基質の中で、アクチン線維架橋因子EPLINのERKによるリン酸化が膜ラフル形成に必要であること、wound healingにおける細胞先端においてEPLINがERKによりジン酸化されること、EPLINリン酸化が細胞運動性に重要であることを示した。また、核膜孔構成因子Nup50がERKリン酸化によりimportinβとの相互作用が低下することを示した。核内転写因子解析のため、上記システムと細胞分画法を組み合わせることにより、ERKによってリン酸化される新規転写因子およびクロマチンジモデジング因子を同定した。さらに、特定のキナーゼを用いて試験管内リン酸化反応によりキナーゼ基質を同定するシステムを構築した。このシステムは、細胞内全タンパク質の抽出、ホスファクーゼ処理によるリン酸化タンパク質の脱リン酸化反応、キナーゼ添加によるリン酸化反応、リン酸化タンパク質精製、2次元ゲル電気泳動またはLC-MSによる基質同定から構成され、特定のキナーゼ基質のみをリン酸化タンパク質とすることにより、基質同定を容易にしたものである。このシステムを利用して、p38 MAPキナーゼ基質を網羅的に積索し、2次元ゲル電気泳動では同定できなかった新規基質を同定した。この中には、核内転写因子、シグナル伝達系因子が多数含まれていた。